חלבון ממברנה Assay Overlay: פרוטוקול בדיקת אינטראקציה בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים במבחנה

בדיקת חלבון. אינטראקציה בין חלבונים היא חיונית להבנת התפקוד של חלבונים. סרטון זה מציג בדיקת קישור בין חלבונים in vitro לבחינת האינטראקציה בין חלבון קשור לממברנה או חלבון מקובע לבין חלבון מסיס.

ראשית, מבצעים שיבוט, ביטוי ומיצוי של חלבוני היתוך. החלבון הבל מסיס המסומן מקובע על ממברנת ניטרוצלולוז ועובר תהליך קיפול מחדש למבנהו הטבעי. לאחר מכן, סורקים את הממברנה באמצעות חלבונים מסיסים מסומנים ומבצעים אימונו-בלוטינג (immuno blotting) לזיהוי החלבונים.

אם החלבונים המסומנים מקיימים אינטראקציה, הם נלכדים על ידי החלבון המקובע לממברנה, ואיתו ייראה אות מה-immuno blotting. לפיכך, בדיקה זו מספקת שיטה מהימנה לבחינת אינטראקציה בין חלבון בלתי מסיס לחלבון בתמיסה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון GST pull down, הוא היכולת להעריך באופן מהימן את הקישור בין חלבון בלתי מסיס לחלבון מסיס in vitro.

השלב הראשון של פרוצדורה זו הוא יצירת חלבונים מתויגים גנטית לצורך זיהוי. התחל בשיבוט של החלבון שיוצמד לממברנה. התייחס אליו כאן כ-pro Im עבור החלבון המוצמד (immobilized protein) אל תוך וקטור ביטוי, המקודד לתג גדול כגון GST; וקטור הביטוי הריק, המקודד לתג בלבד, ישמש כביקורת שלילית לחלבון המוצמד, והוא מכונה pro IM nc.

בשלב הבא, שבטו את החלבון שישמש כגשש מסיס לתוך וקטור ביטוי, המקודד לתג שונה כגון strep two. חלבון זה ייקרא prosol עבור soluble protein. כביקורת שלילית, שבטו חלבון מסיס המשמש כביקורת שלילית לתוך אותו וקטור ביטוי. זה ייקרא Prosol NC עבור soluble protein negative control.

בשלב הבא, השתמש במערכת ביטוי חלבונים כגון coli או נגיף balo כדי לבטא את החלבונים המסומנים. יש לבחור את מערכת הביטוי בזהירות בהתאם לדרישות למודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות. הוצא את החלבונים המבוטאים מהאורגניזם הנבחר. עבור pro IM ו-pro I mnc Resus.

שעו את התאים בבופר טעינה ל-SDS page המכיל תערובת מעכבי פרוטאז. לאחר מכן, הרתיחו את התאים למשך חמש דקות, וצנטריפוגו אותם כדי להסיר את המשקע לצורך מיצוי Prosol ו-prosol NC. השתמשו בפרוטוקולים סטנדרטיים. ניתן למצות את pro IMS בתנאי דנטורציה, כיוון שהחלבונים יעברו קיפול מחדש לאחר קיבועם בממברנת הניטרוצלולוז.

עם זאת, יש להפיק את ה-prosol כדי לספק אישור טבעי (native confirmation), כיוון שהם יתווספו לתמיסת הקישור (binding buffer) לאחר הפקת החלבונים המסומנים. קבע את ריכוז החלבונים הרקומביננטיים באמצעות שיטה סטנדרטית כגון ערכת בדיקת חלבונים של BioRad. זאת במקרה שבו ייעשה שימוש בתמצית גולמית (crude extract) במקום בחלבון מטוהר לצורך הבדיקה.

העריכו את ריכוז החלבון הנחקר באמצעות דנסיטומטריה סורקת של הפס המתאים בג'ל SDS-polyacrylamide שנצבע ב-kumasi, תוך שימוש בריכוזים ידועים של BSA כרפרנס. לאחר מכן, שרטטו את עקומת הסטנדרט בהתבסס על עוצמות האות שנמדדו בדנסיטומטריה הסורקת של ה-BSA, וחשבו את כמות החלבון הנמצאת בתמצית הגולמית.

השלב הבא של הפרוצדורה הוא קיבוע של pro Iam ו-pro IAM NC על הממברנה. התחילו בהעמסה של מיקרוגרם אחד מכל אחד מתמציות ה-pro Iam וה-pro IAM NC, בשכפולים, על ג'ל SDS poly acrylamide. לאחר האלקטרופורזה, הוציאו את הג'ל מלוחות הזכוכית והניחו אותו ב-100 milliliters של תמיסת מעבר (transfer buffer), ולאחר מכן הדגירו עם ערבוב עדין למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.

בעקבות הדגירה, בצע western blot להעברת החלבונים לממברנת ניטרוסלולוז, ולאחר ההעברה אפשר לחלבונים הקשורים לממברנה להתקפל מחדש. הנח את הממברנה ב-15 milliliters של בופר A ודגור אותה תחת ערבוב עדין. כדי להסיר SDS ששאר, דגור למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר תחת ערבוב עדין.

לאחר הדגירה, הוצא בזהירות את הממברנה מהבופר. לאחר מכן, הנח את הממברנה ב-25 milliliters של בופר דנטורציה. הדגר למשך שעתיים בטמפרטורת החדר תוך כדי ערבוב עדין.

במהלך האינקובציה, ממברנת הניטרוצלולוז תהפוך לאטומה. לאחר מכן, העבירו את הממברנה באמצעות פינצטה ל-25 milliliters של TBS והדגירו עם ניעור עדין למשך חמש דקות. בשלב זה, הממברנה חוזרת לצבעה הלבן המקורי.

בשלב הבא, העבירו את הממברנה ל-25 milliliters של חוצץ קישור (binding buffer). דגרו בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס עם ניעור עדין למשך לילה. לאחר מכן, נעשה שימוש בחלבון המומס כדי לבדוק את הממברנה עבור החלבון המקובע.

ראשית, הכינו את בופרי ההיברידיזציה: דללו 1 עד 10 מיקרוגרם של prosol ו-prosol NC במבחנות נפרדות המכילות 10 מיליליטר של בופר קישור (binding buffer) טרי. לאחר מכן, העבירו את הבופר לשקית היברידיזציה. בשלב הבא, גזרו את הממברנה לשני פסים, שניהם מכילים pro IM ו-pro IAM nc.

ממברנות אלו יוכנסו לתמיסות ההיברידיזציה. העבירו כל ממברנה לתמיסות ההיברידיזציה prosol או prosol NC והדגירו למשך 1.5 שעות בטמפרטורת החדר תוך כדי ערבוב עדין. הוציאו את הממברנות מתמיסות ההיברידיזציה ושטפו אותן שלוש פעמים למשך 15 דקות ב-TBS.

כדי להדמיאן אינטראקציות בין חלבונים, חסמו את הממברנה באמצעות 2.5% skim milk ב-TBST למשך שעה אחת. לאחר הדגירה, הניחו את הממברנות החסומות בתמיסת הנוגדן הראשוני. במקרה זה נעשה שימוש ב-anti strep two polyclonal rabbit antibody.

דגרו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין לאחר הדגירה. שטפו את הממברנות ב-20 milliliters של TBST למשך 15 דקות, ופעמיים למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין. לאחר מכן, הניחו את הממברנות בתמיסת הנוגדן השני המצומד ל-HRP; כאן נעשה שימוש בנוגדן anti rabbit IgG המצומד ל-HRP.

דגרו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר תוך כדי ערבוב עדין. שטפו את הממברנות ב-20 milliliters של TBST למשך 15 דקות, ופעמיים נוספות למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין כפי שבוצע קודם לכן; לאחר השטיפה הסופית ב-TBS, הדמינו את האינטראקציה בין החלבונים באמצעות סובסטרט כימילומינסנטי HRP (מבית Millipore, Molan Western Chemiluminescent).

משתמשים בתשתית HRP לאחר ביצוע אימונו-בלוטינג של ה-prosol. יש לשטוף את הממברנה ב-TBST למשך 15 דקות, ולאחר מכן פעמיים למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש לבצע דגימה חוזרת של הממברנות באמצעות הנוגדן הראשוני עבור ה-tag ל-pro.

לאחר מכן מוסיפים את הנוגדן המשני המתאים. יש להדמיא את PRO I ו-pro Im NNC באמצעות גילוי כימילומינסנציה כדי לאמת את זהות הפסים שהתקבלו במבחן חפיפת ממברנת החלבון (protein membrane overlay assay). האינטראקציה בין החלבונים A ו-K לבין YFP ו-MP CYFP נבחנה בתאי אפידרמיס של טבק באמצעות השיטה המתוארת בסרטון זה, כפי שמוצג כאן.

כאשר נבדלה השלמה פלואורסצנטית של במולקולות (biomolecular fluorescence complementation), שוחזר אות YFP חזק. אות BFC זה הצטבר ב-Punta להיקף התא, המהווה סימן מאפיין לממברנת הפלזמה מכיוון ש-MP הוא חלבון שאינו מסיס במידה רבה. כאשר החלבון בוטה בחיידקים או בצמחים, אומץ מבחן כיסוי ממברנת חלבון (protein membrane overlay assay) כדי לתקף אינטראקציה זו.

תמציות חלבונים in vitro המכילות מיקרוגרם אחד של GST MP או GST לא מאוחה הופרדו באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד-SDS, ולאחריה העברה חשמלית לממברנת ניטרוסלולוז. כאשר דגימות אלו נבדקו עם soluble a nnk strep two, ה-GST mp הפגין קישור, אך לא ה-GST הלא מאוחה. יתרה מכך, כאשר אותה קבוצת דגימות נבדקה עם חלבון לא קשור, Arabidopsis Cytoplasmic, NADH kinase tagged strep two, לא נצפה קישור, מה שמעיד עוד יותר על הספציפיות של האינטראקציה של A NK MP. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור למלא מחדש את החלבונים המקובעים כראוי בהתאם לפרוטוקול המוצג.