ויזואליזציה של תפקודי נשימה מיטוכונדריאלי באמצעות ציטוכרום C מונואמין / succinate dehydrogenase (COX / SDH) תיוג פעמיים Histochemistry

המטרה הכללית של הליך זה היא לאפשר ויזואליזציה ישירה של חסרים באנזימי הנשימה המיטוכונדריאליים בחתכי רקמה קפואים וטריים. דבר זה מושג תחילה על ידי איסוף חתכי קריוסטט מהאיבר הרלוונטי. השלב השני של ההליך הוא ביצוע צביעת Cox הסטוכימית, ולאחריה צביעת SDH הסטוכימית.

לבסוף, חיתוכי הרקמה עובריםים ייבוש, קיבוע וכיסוי בזכוכית. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות את מידת התפקוד הלקוי של המיטוכונדריה באמצעות כמות הצביעה הכחולה התאית. שלום. היום נדבר על הטכניקה ההיסטוכימית של סימון כפול של Cox ו-SDH.

בעוד שניתן להחיל שיטה זו כדי לחקור מחלות מיטוכונדריאליות, היא יכולה לספק תובנות גם לגבי הזדקנות והסתבכות הדרגתית הקשורה לגיל. לאחר הוצאת המוח מבעל חיים שהוקרב בהתאם להיתר אתי, הקפיאו אותו במהירות על קרח יבש. ניתן לשמור רקמה קפואה בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס, עטופה בנייר אלומיניום, עד לשלב החיתוך.

הכינו את הרקמה לחיתוך קריוגני על ידי הנחת המוח על תושבת קריוסטט והקפתו בתרכובת שיבוץ. הכניסו במהירות את התושבת אל הקריוסטט ואספו חתכים בעובי 14 micron בטמפרטורה של minus 21 degrees Celsius. הפשירו את החתכים על גבי סליידים באמצעות בלוק חימום, ולאחר מכן הניחו לסליידים להתייבש בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.

הניחו את השקופיות בתא צביעה לשקופיות עם רצועות נייר רטובות. מכיוון שזמני התגובה קריטיים במדידה זו, מומלץ לעבד מקסימום 10 שקופיות לניסוי תחת מapay כימי.

הוסיפו במהירות שני מיקרוגרם של bovine CDEs למצע וערבבו היטב באמצעות וורטקס. כדי לפורר את כל הגרגירים של ה-CDEs תוך כדי עבודה תחת המנדף, הגבישו 150 עד 200 מיקרוליטר של מצע דגירה לכל שקופית, והשתמשו בקצה הפ pipette כדי להפיץ את החומר באופן אחיד על פני כל החתכים. דגרו את השקופיות למשך 40 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius.

לאחר 40 דקות, הסירו את מצע האינקובציה מהשקופיות. שטפו את השקופיות ארבע פעמים ב-PBS למשך 10 דקות בכל פעם. לאחר שטיפת השקופיות, החזירו אותן לתא צביעת השקופיות עם רצועות נייר רטובות, תוך עבודה תחת מופת כימי.

הכינו את תמיסת ה-NBT בתוך PBS, תוך הקפדה על הגנה של ה-PMS מאור; ערבלו את התמינה במהירות באמצעות וורטקס. העבירו 150 עד 200 microliters של תמיסת ה-NBT לכל שקופית, והשתמשו בקצה הפ pipette כדי לפרוס את התמיסה באופן אחיד על פני כל החתכים. דגרו את השקופיות למשך 40 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. לאחר 40 דקות, הסירו את עודפי התמיסה מהשקופיות. שטפו את השקופיות ארבע פעמים ב-PBS, למשך 10 דקות בכל פעם.

בצעו דהידרציה לשקופיות למשך שתי דקות בכל אחת מהריכוזים הרצופים הבאים של אתנול: 70%, 70%, 95%, 95% ו-99.5%. לבסוף, השאירו את השקופיות למשך 10 דקות בשלב נוסף של 99.5%. הניחו את השקופיות בזילין למשך 10 דקות, בצעו הרכבה באמצעות LAN והניחו כיסויים.

יש להניח לשקופיות להתייבש למשך לילה או לפחות שעה עד שעתיים באזור מאוורר. נתחי מוח מעכברים מסוג wild type ומעכברים עם הזדקנות מוקדמת מהסוג MT.DNA Mutator סומנו באופן רצופי לפעילות של COX ו-SDH.

פעילות Cox תקינה, המזוהה על ידי צביעה חומה כהה, נראית בהיפוקמפוס של עכברי פרא (wild type). חסרים ב-Cox, המזוהים על ידי צביעה כחולה, נחשפו בהיפוקמפוס של עכברי MT DNA mutator בגילאי 12 ו-46 שבועות. נצפתה ירידה נוספת בפעילות ה-Cox עד גיל 46 שבועות בעכברי M-T-D-N-A mutator, מה שמעיד על החמרה נרחבת של תפקוד לקוי בשרשרת הנשימה.

זמני דגירה לא מספיקים של 10 ו-25 דקות הובילו להפקה מופחתת של תוצר התגובה החום של DAB. זמני הדגירה המקוצרים אפשרו היווצרות של תוצר הסיום הכחול של Foran במהלך הדגירת SDH, מה שהרשים באופן מטעה כי קיימים תאים עם חסרים ב-COX. החלקת הזכוכית במהלך הדגירת COX הובילה אף היא להיווצרות ולהפקה לא מדויקת של תוצר התגובה של DAB.

למרות שניתן לסמן את פעילויות ה-Cox וה-SDH באופן נפרד כפי שמוצג כאן, סימון רצפי הוכח כיתרון באיתור תאים עם תפקוד מיטוכונדריאלי לקוי. דוגמה לבקרת ספציפיות עבור פעילויות COX ו-SDH במוח של עכבר מסוג בר (wild type) מראה סימון שלילי. לכן, זכרו כי העבודה עם הכימיקלים בסימון הכפול של Cox SCH ובפרוטוקול הכימי היא מסוכנת ביותר, ויש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת ביגוד מעבדה מתאים ומסכה, עבודה תחת מנדף כימי, וכן סילוק של תוצר האינקובציה בכל פעם שמבצעים בדיקה זו.