פשוט פרוטוקול Chelex למיצוי DNA מ

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק DNA של מלריה, טפילים ויתושים מחלקי המעי האמצעי ובלוטות הרוק של דגימות חריגות. דבר זה מושג תחילה על ידי חיתוך היתוש בדיוק במפרק שבין הבטן לחזה, ובכך מפרידים את המעי האמצעי מחלק בלוטות הרוק. לאחר מכן, כל חלק נטחן בנפרד במים דה-יוניים.

לאחר מכן, תרחיף הרקמה עובר תמיסת בסיס (lyed) ושטיפה, ומשקע התאים מופק. לבסוף, משקע התאים מומס מחדש ומורתח, וה-DNA מופק. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות DNA באיכות גבוהה של יתושים ושל טפילי מלריה, המתאים לשימוש כתבנית לזיהוי anomlies, מיני וקטורים וגנוטיפ של זיהומי מלריה באמצעות PCR ועיכול על ידי אנזימי הגבלה ספציפיים לאלל.

היתרון המרכזי של טכניקה פשוטה זו על פני שיטות קיימות, כגון מיצוי אורגני ושיטות מיון, הוא שהיא משתמשת במספר קטן מאוד של ריאגנטים בטוחים וזמינים, ודורשת זמן עיבוד קצר בהרבה. כדי להתחיל בדיסקציה של היתוש, הניחו אותו על פיסת פאראפורם קטנה והניחו אותה תחת מיקרוסקופ דיסקציה. כסו את היתוש בטיפה של מים דה-יוניים.

כדי לרכך את הרקמה בגודלה, יש לחתוך את גופת היתוש בדיוק במפרק שבין החזה לבטן. כך יופרדו הראש והחזה מהחלק הבטני. העבירו כל חלק מפורק מהיתוש לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה נקייה ועקרה בנפח 1.5 milliliter, המסומנת מראש עם מספר הזיהוי של היתוש וחלקי הגוף. הסירו את ה-parafilm והשתמשו בנייר Kim wipe טבול ב-70% alcohol כדי לנגב בזהירות את משבת המיקרוסקופ לפני המעבר ליתוש הבא. כדי למסות את ה-DNA של היתוש, שאבו תחילה 20 µL של מים דה-יוניים אל שפופרת הדגימה.

השתמשו בטיפ של הפפטה כדי לגרס את נתח היתוש הטבול עד לקבלת תמיחה אחידה. הוסיפו 100 µL של תמיסת XPBS 1% saponin שעברה עיקור באוטוקלאב אל הומוגנאט הדגימה, וערבבו בעזרת וורטקס עדין. דגרו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.

בשלב הבא, סבבו בצנטריפוגה ב-20,000 G למשך שתי דקות, והשליכו את הנוזל העליון (supernatant). השביעו מחדש את המשקע (pellet) ב-100 µL של one XPBS. לאחר מכן, חזרו על פעולת הסבב.

הוסיפו 75 µL של מים דה-יוניים סטריליים ו-25 µL של תרחיף שרף Cellex 100 בריכוז 20% weight per volume במים דה-יוניים, וערבבו בעזרת vortex בעדינות כדי להשעיות מחדש את המשקע באמצעות מחט היפודרמית סטרילית בכילול 23 gauge שעברה עיקור בלהבת מבערן בנזן. פתחו חור במכסה של מבחנת הדגימה.

הרתיחו את תרחיף הדגימה בבלוק חימום למשך 10 דקות. סובבו בצנטריפוגה ב-20,000 G למשך דקה אחת, והעבירו את תמיסת ה-DNA למבחנה למסמך מסומנת מראש לשימוש כתבנית בתגובות PCR כדי לבדוק את איכות ה-DNA שהופק, ולהגביר אזור בגן mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase subunit four של arthropod mi, שצפוי להפיק פרגמנט של 400 base pair. לאחר מכן, כדי להבדיל בין מיני Ananais Gambia, הגבירו אזור המקיף SNPs באזור ה-intergenic spacer, שצפוי להפיק גדלים של 390 base pairs עבור Ananais Gambia Sens Stricto, ו-315 base pairs עבור ananais api.

לאחר מכן יש לבצע טיפוס גנטי (genotyping) של פולימורפיזמים העמידים לתרופות אנטי-פולאט ב-p falciparum. בצעו nested PCR להגברה של האזור הסמוך לקודוני חומצות האמינו 16 51 59, 108 ו-164. בתוך הגן של ה-dihydro folate reductase בטפיל, בצעו עיכול ספציפי לאלל של האמפליקון כדי לזהות עמידות לתרופות אנטי-פולאט.

פולימורפיזם קשור. בדוק את התגובות על ג'ל 2%AROS. דוגמאות של תוצאות מבדיקות PCR לבדיקת איכות תמצית DNA של יתוש, זיהוי מולקולרי של RABIS וטיפוס גנטי של p falciparum מראות כי שיטת Kelex המפושטת מניבה תוצאות דומות לפרוטוקול השקיעה במלח (salting out) הסטנדרטי, למרות פחות שלבים ופחות מרבע מהזמן, עם איכות DNA דומה בתמציות הרלוונטיות. אין זה מפתיע ששיעורי החיוביות של הדגימות ביחס לאנומליות, למינים מקבילים של Gambia, וכן שיעורי זיהום הפרזיטים, לא היו שונים באופן סטטיסטי על פי מבחן חי-ריבוע של McNear.

הוספת BSA לתערובות התגובה מובילה לעלייה כללית במספר תוצאות ה-PCR החיוביות הודות להסרת מעכבי PCR, הן בפרוטוקול ה-kelex המפושט והן בפרוטוקול ה-salting out הרגיל. עם זאת, עלייה זו לא הייתה מובהקת סטטיסטית, למעט באיכות ה-DNA בתמציות kelex. עיכול של האמפליקון של p falciparum באמצעות אנזים הגבלה ספציפי לאלל מאפשר, לאחר רכישת מיומנות בשיטה, ביצוע גנוטיפיקה של זיהומי מלריה במעי האמצעי ובבלוטות הרוק כדי לזהות אללים של עמידות לתרופות.

ניתן לבצע טכניקה זו בערך ב-37 דקות אם היא מבוצעת כראוי.