פרוטוקול פשוט לclumping טסיות דם בתיווך של
16 במאי 2013
שיטה זו חוקרת את הפנוטיפ הצטברויות טסיות דם בתיווך של Plasmodium falciparum נגועים באריתרוציטים (pRBC) קליני מבודדים. זה מבוצע על ידי בידוד ולשתף דוגרים פלזמה טסיות דם עשיר ובהשעיה של pRBC.
נוהל זה מציע קווים מנחים סטנדרטיים לביצוע בדיקות התגבשות המתווכות על ידי טסיות של בידודים קליניים או מעבדתיים של plasmodium false parem. ראשית, אסוף דם ממטופל נגוע והפר את הכדוריות האדומות הפרוזיות באמצעות סרכוז, ולאחר מכן תרבל וטהר את השלבים הבשלים לא-מיניים. לאחר מכן, אסוף דם מתורם בריא כדי להכין ולתקנן את הפלזמה העשירה בטסיות באמצעות סרכוז.
שלבו את הטסיות ואת הכדוריות האדומות המזוהמות לצורך בדיקת ההצטברות (clumping assay). תוצאות ממיקרוסקופיה של אימונופלואורסצנציה יכולות להראות צבירי *P. falciparum* המתווכים על ידי טסיות. טכניקה זו תוכננה במיוחד למדידת פנוטיפ ההצטברות של *Plasmodium*.
בידודים קליניים בסביבה דלה במשאבים. דווח כי שינויים מינימליים בפרוצדורות מגבירים את ההשפעה על תוצאות בדיקת ה-clumping acid בשטח. לכן, נדרש פרוטוקול ברור וקל למעקב, המותאם לסביבות דלות במשאבים, על מנת להבטיח סטנדרטיזציה בין אתרי שטח אנדמיים למלריה. בתוך vacutainer המכיל sodium citrate, אספו כחמישה מיליליטרים של דם מלא ממארח שאינו נגוע במלריה, או 2.5 מיליליטרים של דם מחולי מלריה עם CM או SM.
סבב את הדם השלם בצנטריפוגה ב-250 Gs למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבר בזהירות את העלייה העכורה למבחנה נקייה של 15 מיליליטר. זכור כי טסיות דם מופעלות בקלות על ידי שינויים בטמפרטורה וזעזועים פיזיים.
ספרו את תרחיף ה-PRP באמצעות תא ספירה (hemocytometer) והתאימו לריכוז הרצוי באמצעות PBS. כדי לקבל משקע של פלזמה דלה בטבח (PPP), הפרידו את מרבית הטבחים מחלק של פראקציית ה-PRP באמצעות סרכזגה ב-1500 GS למשך 10 דקות. אחסנו את פראקציות ה-PRP וה-PPP בטמפרטורה של 4°C למשך עד 8 עד 10 ימים. רצוי להשתמש בטבחים טריים עבור בדיקת ההתקבץות (clumping assay).
שטוף את משקע תאי הדם האדומים הפריפריים שלוש פעמים עם 5 עד 10 מיליליטר של RPMI 1640 בבקבוק תרבית. הוסף ל-PRBC מצע תרבית סטנדרטי למלריה ותאי דם אדומים טריים שאינם נגועים כדי להגיע להמטוקריט של 5%. חמצן את בקבוקי התרבית בתערובת של 92.5% חנקן, 2.5% חמצן ו-5% פחמן דו-חמצני. לאחר מכן, אטום והעבר לתרבית להבשלת טפילים מ-pbcs של מטופלים.
דגרו את בקבוק התרבית למשך 24 עד 36 שעות באינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ובריכוז של 5% carbon dioxide. הניחו כ-10 עד 15 microliters של דם בקצה אחד של זכוכית מט המונחת על משטח שטוח. געו בטיפת הדם באמצעות קצה של זכוכית שנייה, תוך החזקת הזכוכית השנייה בזווית של 45 מעלות, עד שהדם יימרח באופן שווה לאורך קצה הזכוכית השנייה.
מרחו את הדם באופן אחיד על הזכוכית הראשונה במהירות אך בעדינות, מבלי להפעיל לחץ רב מדי. לאחר מכן, ייבשו את שכבת הדם הדקה באוויר, ובצעו דהידרטציה לאזור הדגימה באמצעות methanol למשך 10 שניות. ייבשו שוב באוויר, ולאחר מכן טבלו את הדגימה ב-2%keem.
השאר למשך 10 דקות לפחות. שטוף היטב עד שהמים יוצאים צלולים והייבש באוויר. בחן את הדגימות תחת עדשת שמן 100x במיקרוסקופ אור.
בשלב הבא, טהרו וסנכרנו את ה-PRBC, ה-PFS parum הבשלים, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. העבירו את התרבית למבחנה נקייה וסטרילית בנפח 15 מיליליטר. השקיעו את התאים על ידי סבוב בצנטריפוגה בטמפרטורת החדר במהירות של 370 GS למשך חמש דקות.
כעת שאבו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) מבלי להפריע למשקע (pellet). לאחר מכן, השביו את התאים באופן שבו מחצית מהנפח הכולל תהיה jello fusing. שליש מהמחצית השנייה יהיה מצע נטול חלבון (protein free medium) ושני שליש מהמחצית השנייה יהיו pbcs.
העבירו את התרחיף למבחנה סטרילית של 15 מיליליטר והדגירו למשך 15 עד 20 דקות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עד להיווצרות הפרדה ברורה בין השכבה העליונה לתחתונה. העבירו בזהירות את השכבה העליונה למבחנה סטרילית חדשה של 15 מיליליטר, הוסיפו 10 מיליליטר של RPMI טרי וסבבו בצנטריפוגה ב-370 עד 430 ×g למשך חמש דקות. לאחר מכן, השליכו בזהירות את supernatant.
כעת הערך את עומס הטפילים ואת שלב ההתפתחות באמצעות מריחת דם דלילה ובחן תחת מיקרוסקופ אור כפי שתיארנו קודם לכן. התאם את תרחיף ה-P RBC שהתקבל לאחר ציפה בג'ל פלזמה לריכוז של 1×10⁸ P RBCs למיקרוליטר במבחנה נקייה של 1.5 מיליליטר. השעה את ה-pbcs בהמטוקריט של 5% ב-aine orange או ב-atherium bromide בריכוז סופי של 20 µg/mL, ו-PRP ב-10% מהנפח הכולל.
באופן דומה, הכין את הביקורות הבאות: תאי דם אדומים שאינם מזוהמים, PRP ו-PRBC עם PPP, כדי לקבוע את תפקידם של הטסיות בהיווצרות גושי ה-PBC. כעת, העבר את התושה לבקבוקון עם פקק הברגה בנפח של 2 ml. הנח את הבקבוקון תחת ערבוב עדין באמצעות גלגול ב-10 עד 12 RRP בטמפרטורת החדר, תוך דגימה במרווחי זמן של 15 עד 20 דקות למשך 120 דקות בסך הכל, כדי לבדוק היווצרות גושים.
טפטפו 10 µL מהדגימה על עלית זכוכית וכסו בכיסוי זכוכית לבחינה תחת פלואורסצנציה. גוש נחשב לצביר של שלושה או יותר של תאי דם אדומים נגועים. בניסוי זה נבדקו כ-70% מהשלבים הבוגרים של p FALs לאחר העשרה באמצעות ציפה בג'ל פלסמה; גושים מזוהים בקלות תחת המיקרוסקופ גם תחת תאורה רגילה. הם נראים כצבירי תאים ותחת פלואורסצנציה כנקודות ירוקות או אדומות.
בעת צביעה בצבעי acridine orange או ethidium bromide בהתאמה, גודל הצבר גדל באופן משמעותי לממוצע של יותר מ-15 pbcs לצבר לאחר דגירה של 120 דקות, כאשר חלק מהצברים הכילו מספר רב של pbcs לצבר שלא ניתן היה לספור באופן חזותי. תדירות הפנוטיפ של ההצטברות מחושבת כמספר התאים המודבקים הנמצאים בצברים לכל 1000 תאים מודבקים שנספרו בבדיקות כפולות.
לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה ברורה של אופן ביצוע בדיקת התקבצות (clumping assay) של *Plasmodium falciparum* המתווכת על ידי טסיות דם. יש להיזהר שלא להפעיל את הטסיות באמצעות תנועות תלשוליות או שינויים בטמפרטורה. ניתן להשתמש בבדיקה זו גם למדידת התקבצות המתווכת על ידי טסיות דם במקרים של מלריה חמורה.
סקירה כללית
שיטה זו בוחנת את פנוטיפ ההתגבשות המתווך על ידי טסיות של אריתרוציטים מזוהמים ב-Plasmodium falciparum בבידודים קליניים. הפרוצדורה כוללת בידוד ודגירה משותפת של פלזמה עשירה בטסיות עם תרחיף של תאי דם אדומים פנימיים (parasitized red blood cells).
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- מיקרוביולוגיה
- מחקר קליני
רקע
- התגבשות המתווכת על ידי טסיות דם היא תופעה משמעותית בפתולוגיה של מלריה.
- הבנת התגבשות זו יכולה לסייע בהערכת חומרת המחלה במלריה.
- שיטות סטנדרטיות הן חיוניות להשגת הדירות (reproducibility) במחקר.
- מחקר זה מתמקד בבידודים קליניים בסביבות דלות במשאבים.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול סטנדרטי לבדיקות התגבשות (clumping) המתווכות על ידי טסיות דם.
- מדידת הפנוטיפ של התגבשות ב-Plasmodium falciparum.
- סיוע למחקר באזורים אנדמיים למלריה.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- איסוף דם מחולים נגועים ומתורמים בריאים.
- סנטריפוגציה לבידוד תאי דם אדומים נגועים בטפילים ולהכנת פלזמה עשירה בטבקיות.
- קו-אינקובציה של טבקיות עם תאי דם אדומים נגועים בטפילים.
- הערכת התגבשות באמצעות מיקרוסקופיה של פלואורסצנציה אימונולוגית.
תוצאות עיקריות
- פנוטיפ ההתגבשות (Clumping) נמדד בהצלחה בבידודים קליניים.
- זוהו תנאים להפעלת טסיות דם במטרה למזער את השונות.
- התוצאות הצביעו על היווצרות משמעותית של גבשושיות לאחר אינקובציה.
- גודל הגבשושיות עלה באופן משמעותי לאורך זמן, מה שמעיד על התגבשות פעילה.
מסקנות
- הבדיקה מספקת שיטה מהימנה לחקר הפתולוגיה של המלריה.
- סטנדרטיזציה היא חיונית להשגת תוצאות עקביות בסביבות שונות.
- ניתן להתאים שיטה זו לשימוש בסביבות בעלות משאבים מוגבלים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
התגבשות של כדוריות דם אדומות המודבקות ב-Plasmodium falciparum בתיווך טסיות דם מספקת פנוטיפ מדיד הקשור לחומרת המלריה באוכלוסיות אנדמיות. סטנדרטיזציה של בדיקה זו מאפשרת הערכה עקבית של מנגנוני היצמדות של הטפילים באתרים שטח עם משאבים מוגבלים. דבר זה תומך בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מנגנוניים בפיתוח טיפולים אנטי-מלריים, על ידי קישור פנוטיפים in vitro לתוצאות קליניות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של מסלולי היצמדות בין מאחס לטפיל המערבים את הקולטנים CD36 ו-gC1qR/HABP1/p32.
- ערך תפעולי: מספק שיטה סטנדרטית להערכת פנוטיפ של התגבשות (clumping) בבידודים קליניים ללא צורך בהקפאה.
- ערך ניבוי: מקשר בין תדירות ההתגבשות in vitro לבין חומרת המחלה באוכלוסיות חולים, ובכך תומך במחקרי קשר של סמנים ביולוגיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: משתמשת בפלזמה עשירה בטבקיות ובתאי דם אדומים מזוהמים ומטוהרים כדי להפיק קריאות כמותיות של התגבשות.
- שחזוריות: מגדירה את זמני הצנטריפוגציה, הדגירה והדגימה כדי למזער את השונות בסביבות עם משאבים מוגבלים.
- יכולת הרחבה: דורשת ציוד מינימלי (צנטריפוגה, מיקרוסקופ), מה שמאפשר פריסה באתרים שטח אנדמיים למלריה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מקשר בין התגבשות המתווכת על ידי טסיות לבין פנוטיפים של מלריה חמורה שנצפו במקרים של מלריה מוחית בילדים.
- המשכיות תרגומית: מאפשר מעבר מבדיקה של בידודים מהשטח למחקרים מכניסטיים של עיכוב קולטני היצמדות.
- קידום מותאם סיכון: מאפשר תיעדוף של תרכובות או נוגדנים המשבשים התגבשות המתווכת על ידי טסיות במודלים פרה-קליניים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
הבדיקה משתלבת ברצף הגילוי של תרופות למלריה, החל מתיקוף מטרות מוקדם ועד להערכה פרה-קלינית של התערבויות לחסימת היצמדות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי אינטראקציות בין ליגנדים לרצפטורים של טפילים המעורבים בסקווסטרציה (sequestration) ובפתולוגיה מיקרו-וסקולרית.
- סריקה: מספק פלטים כמותיים וסטנדרטיים (תדירות וגודל צבירים) להערכת השפעות של תרכובות על אגרגציה המתווכת על ידי טסיות דם.
- אנליטיקה: מייצר נקודות קצה מדידות — תדירות צבירים ל-1000 תאים נגועים וגודל צביר ממוצע — המאפשרות השוואה בין בידודים ותנאים שונים.
- מחקר טרנסלציונלי: מגשר בין פנוטיפינג in vitro למתאמים קליניים ex vivo מקבוצות של חולי מלריה חמורה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה רב-פעמית להערכת פנוטיפים של היצמדות במגוון זנים של Plasmodium falciparum ובידודים גיאוגרפיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בבידוד של טפילים על ידי כימות של פנוטיפ היצמדות המתווך על ידי רספטורים.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה באמצעות הכנת פלטלטים מוגדרת, העשרת טפילים ושלבי אינקובציה מתוזמנים.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות מסוג go/no-go בתוכניות נגד מלריה על ידי זיהוי תרכובות המעכבות מנגנוני היצמדות פתוגניים.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בקידום מותאם סיכונים על ידי קישור עיכוב התגבשות in vitro להפחתה פוטנציאלית בתוצאות של מלריה חמורה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בפרזיטולוגיה, טיפול בדם ומיקרוסקופיה לצורך הכנה מדויקת של בידודים וזיהוי צבירים.
- תלוי בגישה לצנטריפוגה לצורך הכנת פלזמה עשירה בטסיות וטיהור של אריתרוציטים נגועים בטפילים.
- מחייב סטנדרטיזציה של מהירות הערבוב (10–12 rpm) ומרווחי הדגימה (15–20 min) בין אתרים שונים כדי להבטיח שחזוריות.
- יש להתחשב ברגישות הטסיות לשינויי טמפרטורה ולמאמץ מכני במהלך הבידוד והכנת הבדיקה.
- מוגבל לתוצאות איכותניות וחצי-כמותיות, אלא אם כן הוא משולב עם דימות אוטומטי או ציטומטריה של זרימה לצורך התאמה לסריקה של מספר דגימות גבוה (high-throughput).
