הערכה של נדידת תאי גזע סרטני באמצעות מכשירי microfluidic מידור והדמית תא חייה
23 בדצמבר 2011
מכשיר microfluidic מידור לחקר נדידת תאי גזע סרטני מתואר. פלטפורמה חדשנית זו יוצרת microenvironment סלולרי קיימא ומאפשרת הדמיה מיקרוסקופית של תנועת תאים חייה. מאוד ניעתי תאים סרטניים מבודדים ללמוד מנגנונים מולקולריים של חדירה אגרסיבית, שעלולים לגרום לטיפולים יעילים יותר בעתיד.
המטרה הכללית של הליך זה היא לבחון באופן חזותי ולאפיין נדידה של תאי סרטן דרך התקן מיקרופלואידי בעל תאים מופרדים. דבר זה מושג תחילה על ידי פירוק של נוירוספירות קיימות של תאי גזע של גידול מוחי שגודלו במצע ללא סרום. השלב השני הוא ייצור תבנית מאסטר של Bilayered SU eight ושימוש בליתוגרפיה רכה ליצירת חותמת PDMS בעלת תכנון של תאים מופרדים.
בשלב הבא, הרכיבו את ההתקן המיקרופלואידי וטענו אותו בתאי גזע של גידול מוחי. לבסוף, ביצוע דימוי time-lapse לטווח ארוך של נדידת תאי גזע של גידול מוחי מושג באמצעות מערכת מיקרוסקופית רב-תכליתית (all-in-one). בסופו של דבר, התוצאות מראות כי תאי גזע של גידול מוחי מציגים רצף מחזורי של שלבים מורפולוגיים במהלך נדידתם במרחב מוגבל באופן קיצוני.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון תאי Transwell Boyton, הוא שההתקן המיקרופלואידי מאפשר בדיקה חזותית של תהליך הנדידה, מיקום מבוקר של תאים והגשה מדויקת של פקטורים. לפיכך, לטכנולוגיית המיקרופלואידיקה יש תכונות של בחירה וניווט אמינים, יעילים וחסכוניים של תא בודד. ההשלכות של טכניקה זו חולות על הטיפול בגרורות סרטן ובחזרה של המחלה, שכן ניתוח של תאים בודדים בעלי יכולת נדידה גבוהה עשוי לזהות מטרות פוטנציאליות לטיפול כימותרפי בעתיד.
אף ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי התנהגות נדידה של מערכת סרטנית, ניתן ליישמה גם במערכות אחרות כגון התפתחות עוברית, תגובות חיסוניות, ריפוי פצעים והתחדשות איברים. התחל עם תרחיף תאים של neurospheres שנגזרו מ-BTSC. רכז את התאים בפִיפָה קונית של 15 מיליליטר וסובב אותם בצנטריפוגה ב-900 RPM למשך חמש דקות, אך לא במהירות גבוהה יותר.
שאבו את הנוזל שמעל המשקע (supernatant). לאחר מכן, אפשרו לנוירוספירות להתרחפב על ידי דגירה של 0.5 milliliters של Accutane שחומם מראש למשך 5 עד 10 דקות בטמפרטורה של 37 °C. לאחר הדגירה, פרקו את התאים באופן מכני באמצעות 10 עד 20 תנועות עדינות של פיפט P 100.
לאחר מכן, הוסיפו 1.5 milliliters של מצע תרבית לתאי גזע כדי לנטרל את ה-Accutane, סבבו את תרחיף התאים בצנטריפוגה במהירות של 1300 RPM למשך חמש דקות והשעיו שוב את התאים ב-one milliliter של מצע תרבית לתאי גזע. בדקו את צפיפות התאים באמצעות המוציטומטר והתאימו את הצפיפות ל-20,000 תאים ל-microliter. כדי להתחיל בייצור המאסטר של ה-SU eight, הכינו שתי מסכות פוטומסק באמצעות Adobe Illustrator וסרט שקיפות להדפסה בלייזר בשילוב עם Image Setter.
מסכת הפוטומסק הראשונה מורכבת משני סימני ייחוס (fiducial markers) וממערך של מיקרו-תעלות, והמסכה בשכבה השנייה כוללת את תאי ההשכבה והקליטה. נקה את שתי שכבות המסכה באמצעות איזופרופנול והשאר אותן להתייבש באוויר. כעת, בצע ציפוי ספין (spin coat) לוופר הבסיס (handle wafer) בשכבה בעובי של שלושה מיקרון של פוטורזיסט SU-8, ולאחר מכן בצע אפייה רכה (soft baking).
לאחר מכן, כאשר מסיכת הצילום של השכבה הראשונה במגע הדוק, חשפו את הפוטורזיסט לקרינת uv והניחו לו להיסמיך. לאחר מכן, בצעו אפייה לאחר חשיפה (post bake) ופתחו את הפרוס הפרוס (wafer) המסומך. כסו את אזורי סימני הייחוס (fiducial marker) של פרוס העזר (handle wafer) בסרט דביק (scotch tape).
לאחר מכן, בצעו ציפוי סבב (spin coat) של הפרוסה בשכבת פוטורזיסט בעובי 250 מיקרון. לאחר מכן, קלפו את הסרט כדי לחשוף את הסימנים לצורכי יישור. הניחו את השכבה השנייה של הפוטורזיסט ויישרו את סימני הייחוס (fiducial markers).
לאחר מכן, חשפו לקרינת UV ורפאו את שכבת מסיכת הפוטו השנייה, ולאחריהו בצעו אפייה לאחר חשיפה (post baking) ופיתוח. כעת, בצעו אדסיליזציה (silylation) לתבנית ה-SU-8 באמצעות שיקוע אדים כדי להפחית את הדביקות של פני השטח. הניחו את הפרוסות בתוך כלי ייבוש עם מספר טיפות של תמיסת Tri Chloro cline תחת ואקום למשך שעה אחת לפחות.
התבנית תהיה כעת מוכנה לשימוש ליציקת PDMS באמצעות התבנית. התחילו בערבוב יסודי של בסיס הפרה-פולימר עם החומר המקשה ביחס של 10 ל-1. לאחר מכן, הניחו את התערובת במייבש (desiccator) לצורך ניקוי בועות אוויר בוואקום עד שלא ייראו בועות אוויר.
שפכו את התערובת על המסכה ובצעו ניקוי בועות (degas) פעם נוספת. אם נוצרו בועות אוויר חדשות, יש להקשיח את התבנית על פלטה חמה מפולסת למשך שעתיים בטמפרטורה של 90 °C. לאחר קירור לטמפרטורת החדר, שחררו בעדינות את חותמת ה-PDMS.
כך נחרטים תעלות התרבית ב-PDMS והן מוכנות להרכבת ההתקן המיקרופלואידי. התבנית הראשית (master) ניתנת לשימוש חוזר ליציקה עד שתיסדק או תישחק. כאשר התבנית הראשית הופכת לדביקה, ניתן ליישם שוב את הציפוי למניעת הידבקות.
התחילו ביצירת פתחי כניסה ויציאה במכשיר המיקרופלואידי באמצעות חותמת ה-PDMS. בעזרת מחורר ביופסיה, נקו את חותמת ה-PDMS על ידי השריה ב-70% ethanol למשך 30 דקות, ולאחר מכן שטיפה במים דה-יוניזים למשך 10 דקות. סטריליזו והשלימו את תגובות הצילוב של חותמת ה-PDMS באמצעות אוטוקלאב.
כעת הנח את חותמת ה-PDMS על זכוכית כיסוי מצופה ב-poly L lysine. לאחר מכן, מצפים את ההתקן ב-laminate על ידי מילוי התאים בתמיסת laminate דרך פתחי המאגריים ודגירה למשך לילה ב-37 °C. למחרת, שאב את ה-laminate מההתקן.
לאחר מכן, שטפו את המכשיר על ידי הצפת המערכת פעמיים במצע תרביות לתאי גזע. כעת, טענו 11 µL של תאים מופרדים לאחד ממאגרי הזריעה. במידת הצורך, השתמשו בשאיבה בוואקום כדי לדחוף את התאים אל תוך התא. לאחר מכן, טענו שבעה µL נוספים של תאים למאגר הזריעה הסמוך.
לאחר חמש דקות, מאגרי ההושבה והקבלה יהיו מלאים במצע. כעת יש להניח על המכשיר יריעת PDMS סטרילית בעובי של 0.5 עד מילימטר אחד. ההיצמדות הטבעית של PDMS לעצמו תאטום את המכשיר; לאחר האיטום, הוא מוכן להובלה, דגירה ודימות מיקרוסקופי.
בצעו שיווי temperaturas מוקדם של הביוט (biot), IM, על ידי הפעלתו למשך 45 דקות. כדי לייצב את הטמפרטורה, הלחות ואספקת האוויר, הוסיפו מספר צלחנות עם מים לתא הדגימה כדי להגיע לרמת הלחות המתאימה. הכניסו את המכשיר המוכנה לתא הדגימה של המיקרוסקופ.
מרכזו את המכשיר באמצעות פינצטה מיקרוסקופית. כעת הגדירו את נקודות מיקוד הפוקוס ואת נקודות הזמן באמצעות תוכנת ה-Biot והתחילו בהקלטות ה-time lapse במידת הצורך. לאחר חמישה ימים בתרבית, החליפו את מצע התרבית.
ה-BTCs שנזרעו במכשיר תועדו באופן רציף באמצעות דימויי פאזה. במשך חמישה ימים בתא ההשכבה, תאים בעלי צורה של כישוף נשארו בשלב טרום-הנדידה. עם התקרבותם לפתח המיקרו-ערוץ, מספר תאים התרחבו ויצרו בליטות היצמדות.
רק תא אחד היה מסוגל לתפוס את הכניסה ולבחון את כיוון הנדידה. ברגע שהתא קבע את כיוון הנדידה, הוא המשיך לנוע לאורך כל המיקרו-תעלה במהירות גבוהה וקבועה. בקצה המיקרו-תעלה, התא המשיך לבחון את המרחב הפתוח של תא הקבלה לפני שנכנס אליו סופית.
מתצפית על תאים עם שני מרווחי דימוי שניות, נראה כי כושר הנדידה נוצר בעיקר על ידי פעילות של "blabbing" הדומה לזו של תאי OID. בעת ביצוע הפרוצדורה, חשוב לזכור כי עיצוב המכשיר הוא גמיש עד כדי כך שניתן לשנות את ממדי המיקרו-תעלה כדי להשיג את מידת נדידת התאים הרצויה. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן ליצור מכשיר מיקרו-פלואידי המפריד לתאים בצורה ייחודית ומתאים לתרבית תאי העניין שלכם, ולאחר מכן לבצע דימוי time-lapse לטווח ארוך כדי להגדיר באופן איכותני וכמותי את מאפייני הנדידה של תאים אלו בעקבות פרוצדורה זו.
ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון ריצוף דור שני (next generation sequencing) או מערך DNA (DNA microarray), כדי לענות על שאלות נוספות, כגון מידת השוני הגנטי של תאי הסרטן בעלי יכולת נדידה גבוהה.
סקירה כללית
מחקר זה מציג התקן מיקרופלואידי שתוכנן לבחינת הגירה של תאי גזע סרטניים. הפלטפורמה מאפשרת ויזואליזציה בזמן אמת של תנועת תאים חיים, ובכך מספקת תובנות לגבי המכניזמים של חדירת תאי סרטן אגרסיביים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- מיקרופלואידיקה
- ביולוגיה של הסרטן
רקע
- תאי גזע סרטניים מעורבים בגרורות גידולים ובחזרת המחלה.
- הבנת נדידתם עשויה להוביל לאסטרטגיות טיפוליות טובות יותר.
- בשיטות הקיימות חסרה היכולת לניטור חזותי של תנועת תאים בזמן אמת.
- טכנולוגיה של מיקרופלואידיקה מציעה סביבה מבוקרת לחקר התנהגות תאים.
מטרת המחקר
- פיתוח התקן מיקרופלואידי לצפייה בנדידה של תאי גבעול סרטניים.
- ניתוח השינויים המורפולוגיים במהלך תנועת התאים.
- זיהוי מטרות פוטנציאליות לטיפול כימותרפי באמצעות ניתוח של תא בודד.
שיטות שנבצעו
- פירוק של תאי גזע של גידול מוחי מנוירוספירות.
- ייצור של תבנית SU-8 דו-שכבתית באמצעות ליתוגרפיה רכה.
- הרכבה של ההתקן המיקרופלואידי והטענת תאים.
- דימות time-lapse לטווח ארוך של נדידת תאים.
תוצאות עיקריות
- תאי גזע של גידולי מוח מראים שלבים מורפולוגיים מובחנים במהלך נדידה.
- המכשיר המיקרופלואידי מאפשר בקרה מדויקת על מיקום התאים והגשת גורמים.
- טכניקה זו יעילה יותר משיטות מסורתיות כמו Transwell Boyton Chamber.
- התובנות שיתקבלו עשויות להנחות טיפולים עתידיים בסרטן המכוונים למטסטזה.
מסקנות
- המכשיר המיקרופלואידי הוא כלי מהימן לחקר הדינמיקה של תאי סרטן.
- ייתכן כי הממצאים יתרחבו לתהליכים ביולוגיים אחרים, כגון ריפוי פצעים והתחדשות איברים.
- גישה זו משפרת את הבנתנו לגבי התנהגותם של תאי גזע של סרטן.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
חלוקה למדורים במכשירים מיקרופלואידיים מאפשרת ניתוח ברזולוציה גבוהה של נדידת תאי גזע סרטניים, ובכך נותנת מענה לצוואר בקבוק קריטי בהבנת מנגנוי הגעת גרורות ועמידות טיפולית. פלטפורמה זו תומכת בביטחון חיזוי באישור מטרות (target validation) באמצעות בידוד ואפיון של תתי-אוכלוסיות בעלות נדירות גבוהה הרלוונטיות להתנהגות גידולית אגרסיבית. שילוב של דימוי תאים חיים עם בקרה על הסביבה המיקרוסקופית מציב שיטה זו בנקודת מפתח עבור תהליכי פיתוח באנקולוגיה תרגומית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקר של מנגנוני נדידה בתאי גבעול של גידולי מוח ברזולוציית תא בודד.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי בידוד של תת-אוכלוסיות אגרסיביות לצורך אנליזה מולקולרית בהמשך.
- מסייע בתיקוף תפקודי של מטרות באמצעות תצפית ישירה על פנוטיפים של נדידה.
- משפר את הביטחון החזוי לצורך תיעדוף מטרות טיפוליות הקשורות לגרורות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מכין מערכות מותקפות ומחולקות לתאים (compartmentalized) עבור בדיקות נדידה כמותיות.
- מבצע סטנדרטיזציה של תנאי הבדיקה באמצעות בקרה מדויקת על מיקום התאים והגשת הגורמים.
- מאפשר תהורי עבודה הניתנים לשחזור ובקנה מידה רחב לסריקת תרכובות המשפיעות על נדידה.
- תומך בהערכה מהימנה של התערבויות מועמדות המכוונות להתנהגות תאים פולשניים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלה על ידי סימולציה של התפשטות תאי גידול דרך החללים הבין-רקמתיים של המוח.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לבידוד ולתרבית חוזרת של תאים נודדים.
- מסייע בקבלת החלטות על קידום מבוסס ניהול סיכונים על ידי קישור פנוטיפים של נדידה לפרופילים מולקולריים.
- תומך בהפחתת סיכונים מכנית עבור אסטרטגיות טיפוליות המכוונות לחזרת המחלה ולהתנגדות לטיפול.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות למחקרי נדידה מונחי-השערה, פנוטיפיה כמותית ואנליזה מולקולרית של תתי-אוכלוסיות מבודדות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי מנגנוני נדידה ומעורבות של מסלולים בתאי גזע של סרטן.
- סריקה: מספק פלטפורמות הניתנות לשחזור ומוכנות לבדיקה להערכת תרכובים המשפיעים על נדידה.
- אנליטיקה: מספק מדדי נדידה כמותיים ותוצרי דימיון בזמן אמת לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין התנהגות נדידה in vitro למודלים של פלישה וחזרה של המחלה הרלוונטיים למצב הפתולוגי.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה מודולרית וניתנת לשימוש חוזר, הניתנת להתאמה לסוגי תאים שונים ולשאלות ניסיוניות מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במטרות אונקולוגיות המונעות על ידי נדירה.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה של בדיקות נדירה.
- ערך אסטרטגי: מספק מידע לקבלת החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) והקצאת הון על ידי הבהרת המניעים הביולוגיים של גרורות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות ואסטרטגיות טיפוליות המטפלות בחזרה של המחלה, תוך התאמה לרמת הסיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בייצור התקני מיקרופלואידיקה ובדימות תאים חיים.
- דורש גישה לתשתיות מיקרוסקופיה ואנליזה ייעודיות לצורך דימות לטווח ארוך.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של תכנון ההתקן ושל פרוטוקולי הבדיקה.
- ניתן להתאמה לסוגי תאים שונים ולמודלים של נדידה באמצעות התאמות מתאימות של ההתקן.
- השימוש החוזר בהתקן ותפוקת הבדיקה תלויים באיכות הייצור ובתחזוקה.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:57
BTSC Neurosphere Dissociation
3:00
Fabrication of Bi-layered su-8 Master
4:42
Molding of the PDMS Stamp
5:31
Assembly of Microfluidic Devices and Cell Culturing
7:04
Long-term Time-lapse Imaging of BTSC Migration with BioStation IM
7:46
Time-lapse Recordings of Migrating BTSC
8:40
Conclusion
