מוצק שלב Submonomer סינתזה של פולימרים Peptoid שלהם ואת הרכבה עצמית לתוך מאוד מסודרים Nanosheets

המטרה הכללית של הליך זה היא לתאר שיטה פשוטה ויעילה לסינתזת פפטידים במוצק (solid phase peptide synthesis) ולהרכבה עצמית מימית של פפטידים לננו-גיליונות בעלי סדר גבוה. פפטידים, הדומים במבנהם לפוליפפטידים, הם פולימרים של גליצין מותמר שבהם שרשראות הצד מחוברות לחנקן ולא לפחמן האלפא. התהליך מתחיל בסינתזה של רצף פפטידי ספציפי באמצעות שיטת סוב-מונומר (sub monomer method).

שיטת הסוב-מונומר (sub monomer) מורכבת משני שלבים כימיים פשוטים המכניסים כל מונומר לשרשרת באופן רצפי. ראשית, אמין המחובר לתומך מוצק עובר ברומו-אצטילציה. שנית, הברומיד מוחלף על ידי אמין ראשוני.

שלבים אלו חוזרים על עצמם עד להשגת אורך השלשלת הרצוי. לאחר הארכת השלשלת, הפפטיד מנותק מהתמיכה המוצקה, ושמן הפפטיד הגולמי המתקבל מטוהר באמצעות HPLC ומאופיין כדי להתחיל את ההרכבה העצמית של הפפטידים לננו-גיליונות. תמיסת בופר מימית מדוללת של הפפטיד מוכנה בבקבוק זכוכית ומעורבבת בעדינות. כשלב סופי.

הננו-גיליונות נבחנים תחת מיקרוסקופ. התוצאות מדגימות כי מחזור איטרטיבי של שני שלבים כימיים פשוטים יכול להניב פולימר ספציפי לרצף, אשר מתרכב באופן ספונטני לננו-גיליונות. פפטידים הם מחלקה חדשנית של פולימרים בהשראת ביולוגית, בעלי תכונות הנמצאות בין אלו של חלבונים לבין אלו של פולימרים מסורתיים.

הם חסונים ורב-גוניים מבחינה סינתטית בדומה לפולימרים מסורתיים, אך הם גם ניתנים לכיוונון מדויק וספציפיים לרצף בדומה לחלבונים ו-DNA. פפטידים הופכים לחומר מתקדם לטיפול בבעיות מפתח בביו-רפואה ובמדע החומרים, כגון זיהוי של תרופות ביו-אקטיביות או תכנון של חלבונים מלאכותיים. היתרונות העיקריים של פפטידים כוללים בקרה מדויקת על הרצף, זמינות של אבני בניין מגוונות להפליא, סינתזה יעילה ויציבות בפני פרוטאזות. שיטת הסינתזה הידנית הכללית של פפטידים, הכוללת ציוד בסיסי וריאגנטים הזמינים מסחרית, מתוארת כאן ומאפשרת סינתזה קלה של פפטידים ברוב המעבדות.

הדגמה חזותית של שלבי הסינתזה היא קריטית ומשמשת כנקודת ייחוס בעלת ערך עבור אנשים הנכנסים לתחום הסינתזה על פאזה מוצקה. כאן, לראשונה, מתוארים תהליכי הטיהור והאפיון של פפטיד אמפיפילי בעל 36 מרומרים, וכן ההרכבה העצמית שלו לננו-גיליונות מסודרים מאוד. התחילו פרוטוקול זה עם הגדרת המערך הניסיוני כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

השלבים הבאים יבוצעו בכלי תגובה מזכוכית במקום במחסנית פוליפרופילן חד-פעמית עם מסנן, וזאת לצורך בהירות. לאחר הגדרת המערכת עם 100 milligrams של שרף R amide בכלי תגובה עם מסנן, נפח את השרף על ידי הוספת two milliliters של dimethyl form amide או DMF, וערבב באמצעות בועיות למשך 10 דקות. לאחר מכן, נקה את התמיסה באמצעות ואקום כדי לבודד את השרף הנפוח.

בשלב הבא, הוסף מיליליטר אחד של 20% full methyl pyridine ב-DMF כדי להסיר את הגנת קבוצת ה-FM O. ערבב במשך שתי דקות ורוקן. חזור על תהליך זה במשך 12 דקות, ולאחר מכן שטוף את השרף על ידי הוספת שני מיליליטרים של DMF, ערבוב במשך 15 שניות וריקון.

התחילו בגידול שרשרת הפפטיד עם מחזור הסוב-מונומר הראשון, הכולל שלב ברומו-אצטילציה ושלב דחיקה. עבור הברומו-אצטילציה, הוסיפו 1 mL של ברומו-חומצה אצטית 0.6 M ב-DMF ו-86 µL של די-איזופרופיל-קרבדיאימיד. לאחר ערבוב במשך 30 דקות, רוקנו ושטפו עם 2 mL של DMF.

בשלב הבא, בצעו דחיקה על ידי הוספת 1 mL של אמין בריכוז 1-2 M ב-end methyl pyro genone והדגירו למשך 30 עד 120 דקות. לאחר ההדגרה, רוקנו ושטפו עם 2 mL של DMF. המשיכו להאריך את שרשרת הפפטיד על ידי חזרה על מחזור הסוב-מונומר. לאחר השלמת הדחיקה הסופית, שטפו עם 2 mL של DMF.

לאחר מכן, סגרו את הכלי באמצעות פקק שטיפה למתאן מסוג diora ואחסנו את כלי התגובה עד לשלב הניתוק. כדי להתחיל את הניתוק, העבירו את כל השרף המיובש לבקבוק זכוכית לסינצילציה בנפח 20 milliliter; עבדו בתוך מנדף תוך שימוש בציוד מגן אישי מתאים, הוסיפו ארבעה milliliters של חומצה טריפלואורואצטית, או תערובת ניתוק TFA, לבקבוק הזכוכית וסגרו אותו. ערבבו בעוצמה למשך 10 דקות עד שעתיים בטמפרטורת החדר.

לחלופין, ניתן להשתמש במנער סיבובי (rotary shaker) כדי לערבב את התמיסה. אספו את תמיסת הניתוק של ה-TFA על ידי סינון הסרט (resin) דרך מחסנית סינון חד-פעמית מפוליפרופילן אל תוך מבחנת זכוכית לסנצילציה של 20 milliliter חדשה שנשקלה מראש. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של תערובת ניתוק (cleavage cocktail) טריה כדי לשטוף את הסרט ולאסוף שאריות פפטיד.

חזור על פעולה זו, ושטוף פעמיים. אידה את ה-TFA על ידי נשיפה של זרם עדין של חנקן או באמצעות biot charge. V 10 evaporator red המס את השמן הגולמי בשישה מיליליטרים של תערובת אחת לאחת של aceto nitrile ומים.

לאחר מכן, הקפיאו ויבשו בlyophilization את הדגימה. יש לחזור על תהליך זה פעם נוספת לאחר ה-lyophilization השני. רשמו את משקל המוצר הגולמי, ואחסנו אותו כבנבקת יבשה בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius, תוך איפיון באמצעות שילוב של analytical HPLC ו/או electro spray LCMS.

ניתן לקבוע את טהרת המוצר הגולמי ואת נוכחות המשקל המולקולרי הרצוי על ידי ביצוע הפרוצדורות המתוארות בטקסט. ניתן לאחר מכן לטהר את תערובת הפפטידים הגולמית באמצעות prep HPLC בפאזה הפוכה בהתאם לפרוצדורה הכתובה. סעיף זה מתאר את הפרוטוקול ליצירת יריעות מרצף שרשרת בודדת של פפטיד אמפיפילי ספציפי בעל 36 me.

לאחר שהשרשרת הפפטידית סונטזה, טוהרה ועברה ליופיליזציה, מומס האבקה הלבנה שהתקבלה ב-DMSO להכנת תמיסת מלאי בריכוז שני מילימולר. לאחר מכן, השתמש בקובץ Dr.Glass אחד כדי להכין תמיסת פפטיד בריכוז 20 מיקרומולר. ראשית, הוסף 445 מיקרוליטר של מילי Q ו-50 מיקרוליטר של תמיסת באפר להיווצרות גיליונות בריכוז 10x.

ערבבו את המבחנה באמצעות וורטקס. לאחר מכן, הוסיפו five µL של תמיסת סטוק של פפטיד בריכוז two mM וערבבו בעדינות. דפי התמיסה שנוצרים נוצרים על ידי ניעור עדין של תמיסת הפפטיד המדוללת במים.

הטיה איטית של בקבוקון הזכוכית הסגור ממצב אופקי למצב אנכי. פעולה זו גורמת להיווצרות דפים; ניעור עדין גורם גם הוא להיווצרות דפים. עם זאת, הדפים נוטים להיות קטנים יותר ובעלי פחות קצוות ישרים עבור דפים רבים באיכות גבוהה.

סובב את מבחנות הזכוכית סביב הציר האופקי באיטיות במשך יום אחד באמצעות מסובב מבחנות (tube rotator) או נדנדה מותאמת אישית לצביעה פלואורסצנטית של הננו-גיליונות; הוסף 1 µL של Nile red בריכוז 100 µM ל-100 µL של תמיסת הננו-גיליונות כדי להגיע לריכוז סופי של 1 µM. Nile red הוא צבע רגיש לסביבה שעוצמת הפלואורסצנציה שלו עולה כאשר הוא ממוקם בסביבות הידרופוביות. לאחר מכן, הכן תמיסת aros בריכוז 1% במים חמים ושפוך אותה לתוך צלחת פטרי מפלסטיק.

יש לוודא ששכבת תמיסת ה-aros בעובי של כשמינית אינץ', ולאפשר לתמיסה להתקרר ללא הפרעה על משטח שטוח. לאחר שה-aros מתקשה, יש להשתמש בשפכטול כדי לחתוך ריבועים של סנטימטר אחד על סנטימטר אחד. לאחר מכן, העבירו את הריבועים החתוכים לעל שקף זכוכית כדי לאסוף את הדפיות באותו מישור. טפטפו מיקרוליטר אחד של תמיסת sheet על פיסת ה-aros.

לאחר שתי דקות, ה-aros אמור לספוג את הבופר ולהשאיר את הדפים על פני השטח. יש לדגום את הדף במיקרוסקופ בתוך 15 דקות. לחלופין, כדי לדגום דפים ותמיסה, טענו 15 µL לתוך גאסקט בקוטר 20 mm ובעובי 0.12 mm על גבי למסחת זכוכית.

כסו את הדגימה בכיסוי זכוכית (cover slip) ובצעו הדמיה תוך מספר ימים לצורך ביצוע SEM של ננו-גיליונות. ראשית, בצעו תכתית פלסמה (plasma etch) לשבבי סיליקון כדי לסייע בספיגה של הננו-גיליונות. לאחר מכן, טפטפו 20 µL של תמיסת גיליונות פפטידים על מצע סיליקון שעבר טיפול בפלסמה והמתינו שלוש דקות. הסירו את עודפי התמיסה באמצעות קצה של נייר Kim wipe, טפטפו 20 µL של מים על הפני השטח ושוב ספגו את עודפי התמיסה כדי להסיר את הבופר והמלחים.

לחלופין, תמיסות דפי הפפטיד עוברות דיאליזה כנגד מים כדי להסיר את הבופר והמלח. במקרה זה, ניתן לטפטף 20 µL מתמיסת הדף שעברה דיאליזה על מצעי סיליקון שעברו טיפול בפלזמה ולהניח להם להתייבש באוויר. לאחר שהתמיסה התייבשה על מצעי הסיליקון שעברו טיפול בפלזמה, ניתן לדגם את הדף ב-SEM באמצעות גלאי in lens באנרגיות קרן שבין 1 kV ל-5 kV.

בוצעו סינתזה, אפיון וטיהור של פפטיד בעל מטען בלוקי של 36 me ספציפי לרצף, המתקפל לננו-גיליות דו-ממדיות בעלות סדר גבוה. האמינים ששימשו לסינתזה של הפפטיד בעל המטען הבלוקי של 36 me היו ethylene diamine ל-phenethyl amine ו-t butyl beta alanine. לאחר הסינתזה, הפפטיד הגולמי נותק מהשרף באמצעות 95% aqueous TFA.

לאחר איסוף תמיסת ה-TFA ואידויה, טוהרה פפטיד ה-block charge הגולמי בעל 36 me באמצעות HPLC פאזה הפוכה. לאחר מכן, אוששה המסה של פפטיד ה-block charge המטוהר באמצעות moldy.

המסה שנצפתה, 4981.2, תואמת במידה רבה למסה המחושבת של 4981.74. האבקה הלייופיליזית הומסה ב-DMSO להכנת תמיסת סטיב (stock solution) בריכוז של שני millimolar ונשמרה בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius. דפי דגימה הוכנו לפי הפרוטוקול שהוזכר לעיל ודומיימו באמצעות מיקרוסקופיה אופטית פלואורסצנטית.

נצפו מגוון של צורות עם גדלי מאפיינים המגיעים עד 300 מיקרון, ובמיוחד בלטו קצוות ישרים. SEM שימש גם להדמיית הדפים, ובאופן דומה נחשפו קצוות ישרים בולטים. סרטון זה מתאר פרוטוקול פשוט ויעיל לסינתזה של פפטידים על פני שטח מוצק ולהרכבה עצמית מימית של פפטידים למבני ננו-דפים.

מאחר ומאות אבני בניין של חומצות אמינו זמינות באופן מיידי ויש להשתמש בהן בפרוטוקול זה, מרחב התכנון הנגיש באמצעות פוליפפטידים הוא למעשה בלתי מוגבל. פפטידים הם חומרים מבטיחים למחקר בביו-רפואה ובננו-מדע בשל הגמישות הסינתטית, העמידות והסדר שלהם. ברמה האטומית בפרט, ננו-גיליונות אלו משמשים כפלטפורמה פוטנציאלית לפיגומים לתצוגה דו-ממדית, ממטיקה של ממברנות, חיישנים ביולוגיים, ממטיקה של חלבונים וייצור מכשירים.

עבודה עם ריאגנטים מאכלים כגון trior, חומצה אצטית וחומצה ברומו-אצטית היא מסוכנת ביותר; כדי למנוע פגיעות, בצעו את כל התגובות במנדף ואמצו ציוד מגן אישי מתאים.