שיטה פשוטה הדמיה ארבידופסיס מותיר שימוש Perfluorodecalin כנושאת הדמיה Infiltrative
16 בינואר 2012
אנו מתארים את השימוש perfluorodecalin כמדיום הרכבה infiltrative. זוהי שיטה פשוטה לשיפור עומק הדמיה ארבידופסיס thaliana עלה רקמה עם השפעה פיזיולוגית מינימלית.
המטרה הכוללת של הליך זה היא למזער את הדגרדציה של תמונות ביולוגיות הנגרמת על ידי חללי אוויר בעלי העלה, כדי להשיג תמונות ברורות יותר של תאים חיים בתוך העלה. אם העלה מורכב בתווך הרכבה מימי ופלואורופור מעורר על ידי לייזר, חללי אוויר רבים שאינם מלאים ושינויים במקדם השבירה בתוך הרקמה המוצגת בכתום מגבילים את עוצמת האות המגיע מעומק הרקמה בתמונה המתקבלת. אם העלה מורכב במקום זאת ב-per fluoro deline או PFD, עירור הלייזר של הפלואורופור פחות נחלש ומאפשר העברה טובה יותר של אותות שנפלטו.
בסופו של דבר, שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית עם סריקת לייזר בשילוב עם תוך המטבקה PFD מספק תמונות ברורות של תאים חיים בתוך עלה הצמח בעומק הגדול פי שניים מהעומק האפשרי בעת שימוש בתוך מטבקה מימי. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון קיבוע או מטבקה של עלים ותוך מימי, הוא שהיא מפחיתה את השבירה בתוך המזופיל ומאפשרת הדמיה מדויקת יותר של תאים חיים בעומק רב יותר בתוך העלה, דבר שהיה בעייתי בעבר. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח במדעי הצמחים, כגון בחינת ביולוגיה של תאי המזופיל ואיתות in vivo, התאושבות של פתוגנים בעלים ואינטראקציות של פתוגנים בתוך הרקמה, ובכך לספק תובנות לגבי ביולוגיה בסיסית של הצמח.
ניתן ליישם זאת גם על רקמות אחרות בעלות מקדם שבירה גבוה העשירות בחללי אוויר, כגון שבלול האוזן או ריאות של חולייתנים. את הפרוצדורה זו ידגים ד"ר George Littlejohn מהמעבדה שלי ב-Mount Leaf. הדגימות ב-PFD מתחילות בהכנת סלייד למיקרוסקופ עם אטם חדיר לגז מפולידימטילסילוקסן, או PDMS; PDMS הוא פולימר ויסקו-אלסטי שניתן לעצב אותו כדי לספק תא המותאם לדרישות הניסוי.
השג את שיווי המשקל של ה-PFD עם אוויר על ידי ניעור נפח קטן של PFD בבקבוק מלא באוויר. ניתן להשיג זאת גם על ידי הזרמת בועות אוויר דרך ה-PFD. לאחר מכן, העבר את ה-PFD לצלח פטרי פתוח והצף עליו נבט שלם או עלה חתוך למשך חמש דקות. הרקמה צריכה להפוך לשקופה, באופן המזכיר רקמה מזכוכית (vitrified tissue).
העלים עשויים להיראות כהים או בהירים יותר מאשר לפני החשיפה ל-PFD, בהתאם לתנאי התאורה ולגיל הרקמה שנעשה בה שימוש. לבסוף, מלאו את תא ה-PDMS ב-PFD מאוורר והעבירו בזהירות את דגימות הרקמה מפטרית האינקובציה לתא ה-PDMS. אטמו את הזריקה באמצעות כיסוי זכוכית (coverslip) ובצעו הדמיה.
בהתאם לדרישות הניסוי, עלי חודשים הובאו לדגירה למשך חמש דקות בתמיה של חלבון פלואורסצנטי ירוק רקומביננטי או GFP. בבדיקה מיקרוסקופית של דגימות עלים שדוגרו ב-PFD, נראה כי מרבית חללי האוויר מוצפים ב-GFP רקומביננטי התלוי ב-PFD. ה-GFP מופיע בירוק, והצבע האדום מייצג כלורופיל, פלואורסצנציית לוטו ותאי מזופיל.
ניכר כי העלה מוצף לאחר דגירה עם PFD, אך ייתכן שכיסי אוויר מזדמנים יישארו. תחת תנאים אלו, מים אינם מציפים את העלה. כאן, עלי opsys המבטאים את Venus, וריאנט של YFP הממוקם בציטוסול, דוגרו והורכבו באוויר, במים או ב-PFD לסריקה בלייזר. מיקרוסקופיה קונפוקלית של הדגימות מראה יתרון של PFD על פני אוויר ומים, עם עלייה של פי שניים בקירוב בעומק הדימוג.
בעת השוואה בין PFD למים, ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצעה תוך חמש עד 10 דקות אם היא מבוצעת כראוי. במהלך ביצוע הליך זה, חשוב לזכור ש-perfluorodecalin ממיס לק ציפורים וטפלון, אך הוא תואם לגריז סיליקון. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו להבין היטב כיצד להשתמש ב-perfluorodecalin כמצע הרכבה לשיפור הדימוי בתאי עלי צמחים.
אל תשכחו כי למרות ש-per fluoro delin אינו רעיל, אנו ממליצים לאמץ נהלי בטיחות סטנדרטיים בעת ביצוע פרוצדורה זו.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר את השימוש ב-perfluorodecalin כמדיום הרכבה חודר לשיפור עומק הדימוי ברקמת עלה של Arabidopsis thaliana. שיטה זו ממזערת את ההשפעה הפיזיולוגית תוך שיפור הבהירות של תמונות של תאים חיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של הצמחים
- טכניקות דימות
- ביולוגיה של התא
רקע
- חללי אוויר בעלי פืช פוגעים באיכות של תמונות ביולוגיות.
- תוכני הרכבה מימי מגבילים את עוצמת האות בדימות.
- פרפלואורדקלין (PFD) מפחית את השבירה ומשפר את הדימוי.
- ניתן להחיל טכניקה זו על רקמות אחרות בעלות מקדם שבירה גבוה.
מטרת המחקר
- לשיפור עומק הדימוג של תאים חיים בעלי עלים של צמחים.
- לקבלת תמונות ברורות יותר לצורך חקר הביולוגיה של הצמח.
- לסיוע במחקר על ביולוגיה של התא ואינטראקציות עם פתוגנים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של תא PDMS חדיר לגזים.
- השגת שיווי משקל של PFD עם אוויר.
- דגירה של דגימות עלים ב-PFD.
- דימוי באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית סורקת בלייזר.
תוצאות עיקריות
- PFD מאפשר העברה טובה יותר של אותות שנפלטו.
- עומק הדימוי גבוה פי שניים לפחות בהשוואה למדיומים מימיים.
- מרבית חללי האוויר בעלים מוצפים ב-PFD.
- ניתן לבצע את הטכניקה במהירות וביעילות.
מסקנות
- פרפלורודקלין הוא מדיום קיבוע יעיל עבור דימות.
- שיטה זו משפרת את חקר התאים החיים בצמחים.
- יש להקפיד על נהלי בטיחות סטנדרטיים במהלך הפרוצדורה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימוי ברזולוציה גבוהה של רקמות צמחים חיים מוגבל לעיתים קרובות על ידי חוסר התאמה במקדם השבירה וחללי אוויר, אשר פוגעים באיכות האות ובעומק החדירה. שימוש ב-perfluorodecalin (PFD) כמצע דימוי חודר מאפשר ויזואליזציה עמוקה וברורה יותר של תאים חיים ללא פגיעה פיזיולוגית. יכולת זו תומכת בתובנות ביולוגיות מהימנות ובעלות כושר ניבוי גבוה יותר בשלבי הגילוי המוקדמים ובשלבי פיתוח הבדיקות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של תהליכים תאיים ואיתות ברקמות צמחים שלמות ורלוונטיות מבחינה פיזיולוגית.
- מפחית ארטיפקטים אופטיים, ובכך תומך בתיקוף מדויק יותר של מטרות פונקציונליות במטריצות ביולוגיות מורכבות.
- משפר את רמת הביטחון החזויה עבור היפותזות ביולוגיות המשך על ידי מזעור ארטיפקטים הנגרמים מדימות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מקל על הכנת דגימות חיות עם נגישות אופטית עבור בדיקות דימות כמותיות.
- תומך בתנאי דימות הניתנים לשחזור על ידי מזעור אי-התאמות במקדם השבירה והנחתת אות.
- מאפשר הערכה אמינה של רהפורטרים פלואורסצנטיים וסמנים תאיים בתהליכי סריקה.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- ניתן להחלה על רקמות אחרות עשירות בחללי אוויר, דבר התומך ברציפות תרגומית במודלים של צמחים ופוטנציאלית גם במודלים של בעלי חיים.
- מספק הפחתת סיכונים מנגנונית על ידי מתן אפשרות לתנאי דימות דמויי in vivo עבור מחקרים פרה-קליניים.
- משפר את ההלימה בין תוצרי דימות משלב הגילוי לבין הדרישות של המודל הפרה-קליני.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline & Workflow Integration)
דימות מבוסס PFD משלב בין שלבי הגילוי המוקדמים לפיתוח בדיקות (assays), ומאפשר ויזואליזציה ברמת דיוק גבוהה, החל מבדיקת השערות ועד לתיקוף של מודלים פרה-קליניים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך במחקרים מונחי-השערה על ידי מתן אפשרות לדימוי עמוק של רקמות חיות עם מזעור של ארטיפקטים.
- סריקה: מספק פלטי דימוי כמותיים הניתנים לשחזור לצורך ניתוח השוואתי של תנאי ניסוי.
- אנליטיקה: משפר את אמינות המדידה על ידי הפחתת אובדן אות ועיוות אופטי בעומק.
- מחקר תרגומי: מגשר בין מתודולוגיות דימוי במערכות צמחים ובעלי חיים שבהן חללי אוויר מהווים גורם מבלבל.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע שיפור דימוי בעל יישום רחב עבור מודלים ביולוגיים מגוונים הדורשים ויזואליזציה של רקמות עמוקות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בדימות רקמות חיות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תהליכי העבודה בדימות ושיפור השחזוריות בין ניסויים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת יותר לגבי המשך או הפסקת הפרויקט (go/no-go) באמצעות אספקת נתונים ביולוגיים באיכות גבוהה יותר בשלבים מוקדמים של התהליך.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון על ידי הפחתת מחסומים טכניים של דימות ברקמות מורכבות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה קונפוקלית וטיפול במדיה של פרפלואורופחמן (perfluorocarbon).
- נדרשים תאי דימות וחומרים תואמים, מכיוון ש-PFD ממיס סוגים מסוימים של פלסטיקים ולכות.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית עבור פרוטוקולי דימות והכנת דגימות.
- ניתן להתאימו לרקמות שונות עשירות בחללי אוויר מעבר לעלי Arabidopsis, תוך התחשבות בדרישות הספציפיות של כל רקמה.
- מגבלות מעשיות כוללות כיסי אוויר שיוריים מדי פעם ואילוצים של תאימות חומרים.
