גיבוש חלקיקים פולימריים Diblock באמצעות טכניקה Nanoprecipitation

המטרה הכללית של הליך זה היא לסנתז ננו-חלקיקים פולימריים באמצעות שיטת שיקוע ננוי (nano precipitation). זאת מושג תחילה על ידי ביצוע תגובת E-D-C-N-H-S ליצירת קו-פולימר של A-P-L-G-A PEG. לאחר מכן, נעשה שימוש בקו-פולימר ה-PLGA PEG ליצירת ננו-חלקיקים, תוך כליאת התרופה או המטען הרצויים באמצעות שיקוע ננוי.

בשלב זה, ניתן לבצע מאפיין ביופיזיקלי בסיסי, הכולל גודל, מטען פני וביעילות טעינת התרופה, באמצעות פיזור אור דינמי, מיקרוסקופיה אלקטרונית חולפת או HPLC. להשלכות של טכניקה זו יש השפעה על טיפול בגידולי סרטן, מכיוון שהננו-חלקיקים יכולים להוביל תרופות אנטי-סרטניות בעלות מסיסות נמוכה, אשר עשויות להיות יעילות יותר מהטיפולים הנוכחיים. שיטה זו עשויה לספק תובנות לגבי הטיפול בסרטן.

ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לחקור מערכות אחרות, כגון תעבורה תאית. ניתן לשלב את הננו-חלקיקים עם ליגנד מכוון ולהדגים את הטכניקה באמצעות סוכן דימות המאפשר ויזואליזציה in vivo או in vitro. היום יצטרפו שני טכנאים מהמעבדה שלנו, Rohit Sukumar ו-Natalie Cummings. כדי להתחיל בסנתזה של ה-PLGA PEG co-polymer, המסס PLGA, carboxylate ב-Acetonitrile בריכוז של 5 mM תוך כדי ערבוב עדין.

לאחר מכן, הוסיפו NHS ו-EDC בכמות מספקת כדי להגיע לריכוזים של 25 millimolar, המספקים עודף סטוכיומטרי של פי חמישה בהשוואה ל-PLGA. ערבבו בעדינות את התמיסה במשך כשעה אחת כדי לאפשר את המרת ה-PLGA carboxylate ל-PGA NHS. לאחר שעה, השקיפו את תוצר התגובה PGA NHS על ידי הוספת תמיסת שטיפה של methanol בנפח העולה פי 10 בקירוב על נפח התמיסה. סבבו את התמיסה בצנטריפוגה במהירות של 2000 ×g כדי להשקיע את ה-P-L-G-A-N-H-S. לאחר הסבוב, השליכו את העלייה (supernatant) כדי להסיר שאריות של EDC ו-NHS. חזרו על הליך השטיפה ב-methanol לפחות שלוש פעמים.

לאחר השלמת השטיפה, ייבשו את ה-P-L-G-A-N-H-S בוואקום למשך 30 דקות כדי להסיר שאריות של תמיסת השטיפה. כעת, המיסו מחדש את כדורית ה-P-L-G-A-N-H-S ב-aceto NI trial בריכוז זהה לזה ששימש בתחילה להמסת ה-PLGA.

לאחר ההמסה, הוסיפו PEG הטרו-ביפונקציונלי לתמיסת ה-PLGA. הוסיפו ריכוז של 5 mM.

דגרו את תמיסת התערובת למשך 24 שעות תחת ערבוב קבוע. שקיעו את תוצר התגובה של הבלוק-קופולימר PLGA PEG על ידי הוספת מטרנול בעודף. בצעו את תהליך השטיפה והצנטריפוגה שלוש פעמים נוספות כדי להסיר את כל ה-peg הבלתי מגיב שנותר בעודף.

כשלב סופי בסינתזה, ייבשו את ה-PLGA PEG block copolymer תחת ואקום. שיקוע ננו-חלקיקים מתחיל בהמסת ה-PLGA PEG block copolymer והתרופה המיועדת לאנקפסולציה בממס A-P-L-G-A. בחירת הממס היא קריטית שכן היא משפיעה על תכונות הננו-חלקיק. לאחר מכן, הוסיפו את תערובת הפולימר והתרופה, טיפה אחר טיפה, לשלושה עד 10 נפחים של מים תחת ערבול, כדי להגיע לריכוז פולימר סופי של כ-3 mg/mL. טיפה אחר טיפה.

הוספת התמיסה האורגנית לשלב המימי היא קריטית ליצירת ננוחלקיקים בגודל הנכון. המשיכו בערבוב למשך שעתיים תחת לחץ מופחת כדי לאפשר לננוחלקיקים להיווצר על ידי הרכבה עצמית ולהסיר עקבות של הממס האורגני. לאחר שעתיים של ערבוב.

רכז את הננו-חלקיקים על ידי סנטריפוגציה ב-2,700 ×g למשך 10 דקות באמצעות מסנן Amon. לאחר מכן, שטוף את הננו-חלקיקים ב-PBS כדי להסיר תרופה שאינה כלואה, ובצע סנטריפוגציה נוספת. לבסוף, שחזר את הננו-חלקיקים ב-PBS בשלב זה.

ניתן לבצע אפיון ביופיזיקלי בסיסי, הכולל גודל, מטען פני וביעילות טעינת התרופה, כדי להבין טוב יותר את תכונות הננו-חלקיקים. ניתן לאחסן את הננו-חלקיקים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. כדי לאפיין את ננו-חלקיקי ה-PLGA PEG, נעשה שימוש במיקרוסקופיית אלקטרונים חודרת (transmission electron microscopy) כדי לאשש את הגודל, ההתפלגות והמבנה של הננו-חלקיקים. גודל החלקיקים הוא בדרך כלל בטווח הננו-מטר.

גדלי חלקיקים גדולים עם התפלגויות גודל לא אחידות עשויים להעיד על שגיאה בתגובת הצימוד או על כך ששיטת השקיעה הננומטרית (nano precipitation) דורשת אופטימיזציה. מוצג כאן מחקר של קינטיקת שחרור תרופה, שבו נמדדו יעילות הטעינה והשחרור של Paclitaxel באמצעות HPLC סטנדרטי. כמויות קבועות וידועות של הננו-חלקיקים עברו דיאליזה במרווחי זמן קבועים.

התוכן ביחידת הדיאליזה נאסף ונפח שווה של ממס אורגני הוסף כדי להמיס את הננו-חלקיקים. לאחר מכן בוצע HPLC לדגימות אלו. כדי לכמת את תכולת ה-Paclitaxel, לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע נכון את טכניקת הננו-שקיעה הזו בשלוש שעות.

זכרו, בעת ביצוע טכניקה זו, להוסיף תמיד את הפאזה האורגנית באיטיות לפאזה המימית כדי למנוע היווצרות של חלקיקים גדולים לאחר פיתוחה. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרי סרטן בתחום הננו-רפואה לבחון את השימוש בתרופות בעלות מסיסות נמוכה, שבעבר נחשבו לרעילות מדי עבור חולי סרטן בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מחקרי יעילות in vivo או מחקרי דימוי, כדי לענות על שאלות כגון האם תרופות בעלות מסיסות נמוכה הן יעילות, כאשר רעילות סיסטמית אינה מהווה עוד בעיה, או האם ליגנדים מכוונים מנתבים נכון את הננו-חלקיקים ליעדם.