אפיון אלקטרו של ה-GFP, הבעת אוכלוסיות תאים ברשתית אינטקט

המטרה הכללית של הליך זה היא לחקור את התגובות לאור ואת המורפולוגיה של נוירונים בודדים ברשתית שלמה, באמצעות שימוש בקו עכברים המבטא סמן פלואורסצנטי באופן בלעדי בסוגי תאים ספציפיים. הדבר משיג תחילה על ידי ניתוח של העין כדי לקבל רשתית מבודדת. השלב השני הוא הנחת הרשתית תחת מיקרוסקופ סריקה לייזרי והדמיות של תא באמצעות עירור אינפרא-אדום דו-פוטוני.

לאחר מכן משתמשים במיקרופיפט כדי להשיג תצורת patch clamp של תא שלם (whole cell patch clamp configuration) לצורך הקלטה ומילוי בצבע. בסופו של דבר, הכנה זו מאפשרת הקלטות של תגובות תאיות לעירור באמצעות אור (photo stimulation) וחושפת את המורפולוגיה של התא המוקלט באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקאלית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הקלטת patch clamp לא מכוונת מרשתית העין, הוא שניתן לכוון את ההקלטה באופן חזותי לעבר תא מסומן פלואורסצנטית ללא צורך בעירור הרשתית באמצעות אור העירור.

שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח במחקר רשתית העין, כגון מהי התרומה של אוכלוסיית תאים מסוימת לעיבוד מידע חזותי? זאת גם אם לאוכלוסיית התאים צפיפות נמוכה והיא אינה בעלת מאפיינים מורפולוגיים מובחנים העשויים להקל על הזיהוי. התחילו את הניסוי על ידי הסגאת העכבר בחושך למשך שלוש שעות לפחות לפני הניסוי.

בינתיים, הכינו את התמיסה החוץ-תאית כפי שמתואר במאמר המצורף והחליפו את האוויר בה באמצעות קרבוגן בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הקריבו את העכבר והוציאו את העדשות מהעיניים באמצעות מספרי קשת עבור הקשתית. העבירו אותן לצלוחית עם תמיסה חוץ-תאית.

לאחר מכן, הנח אותו תחת מיקרוסקופ דיסקציית (מיקרוסקופ סטריאוסקופי) בעזרת מספרי קפיץ. הסר את הקרנייה ואת הגוף הציליארי על ידי פתיחת גלגל העין לאורך ה-ora serrata. הוצא את העדשה והפרד בזהירות את הרשתית מהאפיתל הפיגמנטי.

לאחר מכן, חתכו את העצב האופטי בין הרשתית לאפיתל הפיגמנטים. הוציאו את הרשתית מתוך גביע העין. שימו לב שהחלק הפנימי של הרשתית המגולגלת הוא צד תאי הגנגליון.

הצד החיצוני הוא צד הפוטורספטורים. לאחר מכן, הסר את הזגוגית מפני השכבה הפנימית של הרשתית על ידי משיכה עדינה בעזרת קיסם עץ. לאחר מכן, בצע חתכים קצרים לאורך היקף הרשתית כדי להקל על יישור הרקמה.

בשלב הבא, העבירו את הרשתית לתא ההקלטה כאשר צד הפוטורספטורים פונה כלפי מטה. פרסו אותה על התחתית הזכוכיתית בעזרת מברשת עדינה וקבעו אותה באמצעות מסגרת פלדת אל-חלד עם חוטי ניילון. הניחו את תא ההקלטה בחשכה תחת מיקרוסקופ סריקת לייזר עומד.

בצעו פיוזציה (Superfuse) רצופה של הדגימה הרטינלית בקצב שאינו נמוך מ-5 mL לדקה. כאשר התמיסה החוץ-תאית מחמצנת חומת ב-35 °C, המיקרוסקופ ממוקם על שולחן אוויר בולם זעזועים בתוך כלוב פאראדיי. לצורך מיסוך אלקטרוני, כסו את הכלוב בכיסוי לא שקוף כדי לשמור על הדגימה בחשכה.

אנו מסננים גם אור ממסכי מחשב באמצעות סרטים שקופים בצבע אדום. כוון את לייזר האינפרה-אדום לאורכי גל של 850 עד 870 ננומטרים או אורכי גל ארוכים יותר. עבור למצב של נעילת מוד (mode locked) והשתמש בעירור דו-פוטוני כדי להדגים תאים המבטאים GFP.

עבור הקלטת patch clamp, מלאו מיקרו-פיפטות מזכוכית בורוסיליקטור בתוך התמיסה התו-תאית המכילה פרוב פלואורסצנטי, כפי שמתואר במאמר המצורף. לאחר מכן, הכניסו את המיקרו-פיפטה למחזיק. וודאו שאלקטרודת הייחוס נמצאת במגע עם התמיסה החוץ-תאית בתא ההקלטה.

בשלב הבא, הפעל לחץ באמצעות המיקרו-פיפט על תא המטרה המבטא A GFP, תוך שימוש בעדשה אובייקטיבית של טבילה במים עם הגדלה של 40; גופי תאי האומיקרון ממוקמים בשכבת תאי הגנגליון וכן בחלק הפרוקסימלי של השכבה הבין-צלולה. לפני שהמיקרו-פיפט בא במגע עם התא המטרה, חדירה דרך הקרום המגביל הפנימי (inner limiting membrane) על פני הרשתית. חדירה מוצלחת מזוהה על ידי יציאת התמיסה התאיכלית (intracellular solution) מקצה המיקרו-פיפט וההיפרדציה של הקרום המגביל הפנימי מרקמת הרשתית שמתחתיו. הצבע הפלואורסצנטי בתמיסה התאיכלית יכול לחשוף את מיקומו של המיקרו-פיפט בתמונת הדו-פוטון בעת ההתקרבות לתא הרצוי.

לאחר מכן, שחרר את הלחץ מהמיקרו-פיפט והשג קונפיגורציית whole cell patch clamp. במצב current clamp, הקלטה שמיש צריכה להניב פוטנציאל ממבנה של 50- עד 55- millivolts ולהימשך לפחות 20 דקות. לאחר מכן, הצג את הגירויים הוויזואליים שנוצרו על מסך המחשב.

כוון את עוצמת הגירוי על ידי החדרת מסנני צפיפות ניטרלית למסלול הקרן, והתאם את המיקום המרחבי של הגירוי למרכז התא המוקלט. לאחר מכן, הפעל את פרוטוקול הגירוי והקלט את התגובות לאור. השתמש במחולל הגירויים כדי להפעיל את תוכנת ההקלטה.

שלבו פוטודיודה בנתיב הקרן כדי לתעד את תזמון הגירוי. היזהרו שלא למשוך את גוף התא בעת נסיגת המיקרו-פיפטה. עם סיום מילוי הצבע, הניחו לחומר הפלואורסצנטי לדיפוזיה אל התא המוקלט למשך 30 עד 45 דקות.

להלן דוגמה לתאים המבטאים GFP במישראתם במישראתם ב-retinal flat mount של טירוזין הידרוקסילאז (tyrosine hydroxylase); ניתן להבחין בין שתי אוכלוסיות על פי עוצמת אות ה-GFP. תאי דופמין מסוג 1, הממוקמים בשכבה הבין-צלולית (interclear layer), מבטאים פלואורסצנציה חלשה, כפי שמוצג על ידי חצי החיצים באיור A. תאים מסוג 2 סומנו בעוצמה רבה וגופי התאים שלהם נמצאים בשכבה זו, כפי שמוצג על ידי החיצים באיור A, או מוסטים לשכבת תאי הגנגליון (ganglion cell layer), כפי שמוצג באיור B. איור C מראה ריבוד דנדריטי של תאים מסוג 2 בשכבה השלישית של השכבה הפלקסיפורמית הפנימית (inner plexiform layer). מוצג כאן דוגמה למורפולוגיה של תא מסוג 2 שהוזרק עם הסמן neuro biotin.

הסמן הודגם מאוחר יותר על ידי קישור לסטרפטאבידין המסומן פלואורסצנטית, המוצג כאן בצבע מגנטה. כאן מוצגים תבניות תגובה שונות של תא מסוג שני הממוקם בשכבת תאי הגנגליון לאור לבן. גירוי ממושך של שלושה שניות שימש להבחנה טובה יותר של מרכיבי התגובה בעת תחילת הגירוי ובסיומו, בעקבות פרוצדורה זו.

ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ניסויים פרמקולוגיים, דימוי סידן או אימונוכימיה, במטרה לענות על שאלות נוספות, כגון התפקיד התפקודי של סוג תא מסוים במעגלי הרשתית.