יישום MassSQUIRM עבור מדידות כמותיות של פעילות Demethylase ליזין

פרוטוקול ה-mass squirm נועד לכמת את הפעילות של ליזין-דמתילאז באמצעות מתילציה איזוטופית ומספקטרומטריית מסות MALDI. ראשית, בצע תגובות דמתילציה המזורזות על ידי אנזים על פפטידים המכילים שאריות ליזין מתילאטיות. לאחר מכן, בצע מתילציה כימית של תוצרי הפפטידים מתגובת הדמתילאז באמצעות פורמלדהיד דאוטרי, כדי להפיק פפטידים מתילאטיים באופן אחיד המיוננים באותה צורה על ידי MALDI. המשך לכימות של כל מין פפטיד באמצעות מספקטרומטריית מסות MALDI תוך התחשבות בחפיפה איזוטופית. כדי לזהות כמויות יחסיות של פפטידים לא-מתילאטיים, מונו-מתילאטיים, די-מתילאטיים וטרי-מתילאטיים, תוצאות ה-mass squirm קובעות את הכמויות היחסיות של כל תוצר של תגובת הדמתילאז על בסיס שינויים במסה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ספקטרומטריית מסות שגרתית, הוא שציון המסות (mass score) לוקח בחשבון הבדלים ביוןזציה בין פפטידים עם רמות מתילציה שונות. הרעיון לגישה זו עלה לראשונה כאשר פיתחנו שיטה למדידת רמות אצטילציה של היסטונים באמצעות אנהידריד אצטי כבד איזוטופית. האתגר בטכניקה זו הוא הפקת נתוני שטח שיא, שעלולה להיות מורכבת בשל חפיפה של מעטפות איזוטופיות של פפטידים.

עבור תגובת הדמתילאז, ערבבו 125 nanograms של אנזים recombinant lysine specific demethylase one עם 0.25 micrograms של פפטיד biotinylated dimethyl hisone H three בנפח סופי של 20 microliters של באפר דמתילאז. הכינו בנוסף דגימת ביקורת המכילה 0.25 micrograms פפטיד ללא האנזים LSD one. דגרו את מבחנות התגובה והביקורת למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 °C. כדי להכין את חרוזי R2 בעאיון של 20 micron, ערבבו נפחים שווים של חרוזים ומתנול.

לאחר מכן, הוסיפו 10 נפחים של TFA formic acid, הוסיפו שמונה מיקרוליטרים של חרוזי נקבוביות (porous beads) לכל דגימה וערבבו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. במקביל, הכינו שני C 18 zip tips. בצעו פיפטינג פעמיים עם 20 µL של 0.1%TFA, ארבע פעמים עם 70% aceto nitrile 0.1%TFA, וארבע פעמים נוספות עם 0.1%TFA.

לאחר מכן, טענו את שתי הדגימות אל ה-zip tips שעברו התנייה. בעזרת פיפט, דחפו את הנפח דרך שרף ה-C 18. חזרו על הפעולה עד שכל הנפח של שתי הדגימות נדחף דרך ה-zip tips.

לאחר מכן, שטפו את ה-zip tips פעמיים עם 20 µL של 0.1% TFA, ואלוטו את הדגימות לתוך 40 µL של elution buffer. המשיכו לייבש את ה-eent לחלוטין באמצעות speed vac concentrator. ראשית, השביו את הדגימה ב-100 µL של 50 mM phosphate buffer pH 7.4. לאחר מכן, הוסיפו 8 µL של bore dimethyl amine ו-16 µL של derated formaldehyde.

דגרו בטמפרטורה של 4 °C למשך שעתיים. חזרו על תהליך המתילציה הרדוקטיבית על ידי הוספה של dimethyl amine ו-formaldehyde דויטרי, ודגרו למשך שעתיים. בפעם השלישית, הוסיפו dimethyl amine ודגרו בטמפרטורה של 4 °C למשך 15 שעות.

עצרו את התגובה באמצעות 12.5 µL של Tris בריכוז 1 M, pH 7.4. ייבשו את הדגימות לחלוטין באמצעות SpeedVac. לאחר מכן, השביו את דגימות הביקורת ואת דגימות ה-demethylase ב-100 µL של phosphate buffer בריכוז 50 mM, pH 7.4.

כעת הוסיפו שמונה µL של חרוזי נקבוביות לדגימות הביקורת ולדגימות התגובה עם הדמתיליז, ואספו אותן באמצעות zip tips כפי שהודגם קודם לכן. בצעו אלוציה בנפחים של שני µL על גבי פלטת דגימות MALDI והניחו להן להתייבש בטמפרטורת החדר עד להיווצרות גבישים. המשיכו לניתוח הדגימות באמצעות ספקטרומטריית מסות.

פתח את קובצי הספקטרומטריה בתוכנת העבודה וייצא אותם לתוכנת M over Z. לאחר מכן, אמת את תוצרי התגובה באמצעות ספקטרומטריית מסות בטנדם. ראשית, קבע את יחס שטח הפסגה של איזוטופי carbon 13 C two ו-carbon 13 C four ביחס לפסגה המוני-איזוטופית עבור דגימת הביקורת.

השתמשו ביחסים מחושבים אלו כדי לכמת את הכמות היחסית של הפפטיד בכל מודיפיקציה. מצב דגימת תגובת הדמתילאז. ניתן להשתמש ביעילות באנזים LSD אחד לכימות המסה של דמתיליזציה של ליזין.

מכיוון שתגובת הביקורת אינה עוברת מתילציה רדוקטיבית, היא מעידה על המעטפה האיזוטופית הטיפוסית עבור פפטיד זה. שטחי הפסגות המתקבלים קובעים את יחסי הרקע של הפפטיד הקיים ב-carbon 13 C two וב-carbon 13 C four. מצבים איזוטופיים, שטחי פסגות מספקטרום המסות עבור תגובת הביקורת, מאפשרים כימות של הכמות היחסית של הפפטיד הקיים בכל מצב מודיפיקציה. בתגובת הדמתילאז, שטחי הפסגות מתגובות ביקורת ותגובות דמתילאז אלו קובעים 33.7%dimethyl lysine 4 42 0.3%monomethyl lysine four ו-24%unmethylated lysine four.

גישה זו של ספקטרומטריית מסות רחבה (mass squam) מספקת תובנות מרכזיות בתחום האפיגנטיקה של ההיסטונים, כגון האופן שבו דמתילציה של שאריות ליזין בהיסטונים תורמת למחלות שונות. בעוד שבדיקת מתילציה זו יושמה למחקר של דמתילאזים, ניתן להשתמש בה גם למחקר של מתיל-טרנספראזים.