כמותי, בזמן אמת, ניתוח של פעילות כריתת מאגר תיקון lysates סלולריים ניצול הנגע ספציפיים משואות מולקולרית

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא למדוד שיעורי תיקון DNA בתמציות גרעיניות של תאים בזמן אמת, באמצעות molecular beacons הפולטים פלואורסצנציה לאחר תיקונם. molecular beacons לתיקון על ידי excised בסיס מורכבים מאוליגו-דאוקסי-נוקלאוטידים במבנה של לולאת גבעול (stem loop) המכילים פגיעה בבסיס בודד, כאשר שש יחידות fluorescein (fam) מצומדות לקצוות ה-5' ויחידות dab sil מצומדות לקצוות ה-3' כאשר המבנה מקופל. פליטת הפלואורסצנציה של fam מדוכאת על ידי dab sil באופן שאינו פלואורסצנטי באמצעות מעבר אנרגיה בתהודה של פורסטר (Förster resonance energy transfer).

כדי להעריך את הפעילות של תיקון DNA, מדגרירים את ה-beacons עם תמציות גרעין של תאים, המכילות אנזימי תיקון. DNA Glycosylate מזהה ומסיר את הנגע ב-DNA ב-beacon. אתרי ה-ABA שנוצרים מהווים סובסטרטים עבור AP endonuclease one או ape one. עם הזיהוי, APE one שבה את שלד ה-DNA באתר ה-ABA, מה שמאפשר ל-DNA המכיל את ה-six fam להתנתק באופן חופשי מהסיכה (hairpin).

ניתוק מהמשקיט (quencher) מוביל לעלייה בفلורסצנציה, שהיא פרופורציונלית לרמת תיקון ה-DNA, וניתן להעריכה בזמן אמת באמצעות מכשיר qPCR כמותי. היכולת לתקן נזקי DNA היא קריטית לכל תא ולכל אורגניזם. מבין השלל הרב של מסלולי תיקון ה-DNA התאיים, תיקון על ידי השהיית בסיסים (base excision repair) מתמקד בבסיסים פגומים שעלולים להיגרם כתוצאה מפגיעות חמצוניות או כימיות; בירור תפקידם של מרכיבים תאיים בודדים שעשויים להשפיע על תיקון על ידי השהיית בסיסים הוא אחת המטרות המרכזיות במחקרים במעבדתנו.

ככזו, מדידה מדויקת ורגישה של פעילות תיקון DNA הפכה למוקד עניין במעבדה שלנו. בדיקה זו יכולה לספק נתונים כאלו. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון סימון ב-32 P וניתוח באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל, הוא שהטכניקה שלנו אינה משתמשת בסובסטראטים מסומנים רדיואקטיבית, יכולה למדוד קצבי תיקון DNA בזמן אמת ובעלת טווח דינמי רחב מאוד.

יתרה מכך, גישה זו יכולה להשתמש במספר פלואורופורים שונים ו/או בנזקי בסיס (base lesions) כדי לקבוע את הספציפיות של הסובסטרט. הראינו כי בדיקה זו היא כמותית מאוד ורגישה ביותר בתנאים שונים. בדיקת ה-molecular beacon לתיקון חיתוך בסיסים (base excision repair) מתאימה לניתוח קינטי.

הרגישות והספציפיות הגבוהות של הבדיקה מאפשרות כימות מדויק של תיקון על ידי כריתת בסיסים (base excision repair), ולכן היא שימושית לסריקות של מעכבי תיקון או לאימותן. בנוסף, ניתן להתאימה למדידת פעילות תיקון של DNA בתוך רקמות ובליזאטים של תאי גידול לצורך מדידות של סממנים ביולוגיים תפקודיים. בעת תכנון מולקולות Beacon שבהן ייעשה שימוש בבדיקה זו, יש לשקול את אוליגו-נוקלאוטידי ה-DNA הבאים, שאורכם 43 בסיסים, כפי שמוצג כאן.

עבודו היטב. רצף ה-DNA אינו ייחודי, אך הוא חייב לאפשר היווצרות של מבנה סיכה. כאשר הוא מקופל כפי שמוצג כאן, סגוליות מושגת על ידי הכנסת פגיעות בסיסים ספציפיות כגון uracil או tetra hydro furin.

במיקום X, שישה בסיסים מהקצה הפרימה (five prime), תוכן ה-GC צריך להיות לפחות 32% ובסיס GB לא צריך להיות ממוקם בקצה הפרימה. שישה carboxy fluorescein או six fam צריכים להיות מצומדים לקצה הפרימה, והקצה הפרימה (three prime) צריך להיות משומהה באמצעות dab sil. זה ישמש כסובסטרט עבור חלבוני תיכון ה-DNA כדי להבטיח קישור ופעילות של ה-glycosyl releases.

מיקום הנגע נבחר כדי לספק מספיק מרווח ממבנה סיכת הראש (hairpin) ומקצה ה-DNA. אורכו של הגבעול או של דופלקס סיכת הראש צריך להיות לפחות 15 זוגות בסיסים. אורך הלולאה המומלץ הוא 13 בסיסים.

הבייקון המולקולרי (molecular beacon) של הביקורת צריך להיות זהה לבייקון המולקולרי הניסויי, למעט העובדה שאין בו נזק ל-DNA. לכן, הוא לא אמור להיות מזוהה על ידי אנזימי תיקון DNA. לאחר קבלת הבייקונים המולקולריים, יש לבצע הערכת איכות כדי לוודא שהבייקונים אינם פולטים פלואורסצנציה עד לחימום.

וכדי לקבוע את טמפרטורת ההמסה האופטימלית, יש לבצע את כל השלבים במהלך הליך המיצוי על קרח או בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. כדי להבטיח את יציבות החלבון, הכינו את הניסוי באמצעות קירור מוקדם: שני כוסי מדידה של 1 liter לכל דגימה, בופר דיאליזה, תאי דיאליזה, מיקרו-צנטריפוגה, מבחנות, מזרקים ומחטים.

סמנו מבחנות קוניות של 15 מיליליטר והניחו אותן על קרח. שאבו את מצע הגידול מהתאים ולאחר מכן שטפו אותם פעמיים עם 7.5 מיליליטר של PBS קר. לאחר השטיפה השנייה, הוסיפו חמישה מיליליטר של PBS קר לכל צלחית והשתמשו במגרדת תאים (cell lifter) כדי לגרד את התאים מהפלטה.

העבירו את התאים לפפפ פלסטיק קוני של 15 מיליליטר שקולקר, ולאחר מכן סבבו בצנטריפוגה במהירות של 500 ×g בטמפרטורה של 4 °C למשך חמש דקות. לאחר הסבוב, הסירו את העלייה (supernatant) והעריכו את נפח התאים הדחוס על ידי השוואה לנפחי נוזל ידועים בפפפים דומים. סבבו את הפפפים פעם נוספת למשך דקה אחת, ולאחר מכן הסירו את ה-PBS שנותר באמצעות פיפטה.

שעלק את משקע התאים ב-150 µL של ריאגנט מיצוי nuke buster extraction reagent one עבור כל 50 µL של נפח תאים דחוס. לאחר מכן, העבר את התאים המשולקקים למבחנה של 1.5 mL שקויררה מראש ובצע ערבוב ב-vortex למשך 15 שניות במהירות גבוהה. לאחר הערבוב, דגור את המבחנה על קרח למשך חמש דקות, ערבב שוב ב-vortex למשך 15 שניות נוספות וסבב בצנטריפוגה ב-13,000 ×g למשך חמש דקות ב-4 °C.

לאחר הסנטריפוגציה, הסירו והשליכו את העל-נוזל (supernatant), המכיל את הפракציה הציטופלזמית. השעו מחדש את המשקע בתערובת של 1 µL של 100x protease inhibitor cocktail, 1 µL של 100 mM DTT ו-75 µL של נאק-בסטר (nuke buster) extraction reagent two, עבור כל 50 µL של נפח תאים דחוס.

בצעו ערבול (Vortex) לתאים למשך 15 שניות במהירות גבוהה. הדגירו על קרח למשך חמש דקות, ובצעו שוב ערבול (Vortex) למשך 15 שניות במהירות גבוהה. צנטריפוגו במהירות של 13,000 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, השתמשו במזרק להעברת העילוי, המכיל את החלבונים הגרעיניים, לקסטת דיאליזה במחלק עם סף משקל מולקולרי של 7,000.

בשלב הבא, הוסיפו 500 µL של DTT בריכוז 1 M ל-500 mL של בופר דיאליזה שקולל מראש, ובצעו דיאליזה לתמצית (lysate) למשך 90 דקות בטמפרטורה של 4 °C תוך כדי ערבוב עדין. לאחר 90 דקות, העבירו את קסטת הדיאליזה לכלי ביקר שני המכיל 0.5 L של בופר דיאליזה מקולל מראש עם DTT, והמשיכו בדיאליזה של התמצית למשך 90 דקות בטמפרטורה של 4 °C תוך כדי ערבוב עדין. לאחר הדיאליזה, ייתכן שהתמצית התגבשה עקב ריכוזי חלבון גבוהים.

בשלב הבא, הכניסו מזרק חדש לתוך פתח שונה מזה ששימש להזרקת הקסטה, ואספו את תמיסת החלבון הגרעיני שעברה דיאליזה מקסטת הדיאליזה. השתדלו לכלול גבישים בעלי מראה עכור בעת הוצאת תמיסת החלבון הגרעיני שעברה דיאליזה. חלקו את הדגימה למבחנות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 20 µL לכל אחת, הקפיאו במהירות על קרח יבש ואחסנו בטמפרטורה של 80- °C עד למועד השימוש.

קבעו את ריכוז החלבון ובצעו בקרת איכות כפי שמתואר במסמך המצורף. לביצוע בדיקת ה-molecular beacon, הפשיתו ודללו את ליסי הקיט (cell lysates) לריכוז של two micrograms per microliter של חלבון באמצעות תמיסת ריאקציה בסיסית לתיקון חיתוך (basic excision repair reaction buffer) המכילה one millimolar של DTT; דללו את ה-molecular beacons לריכוז של 200 micromolar באמצעות תמיסת ריאקציה בסיסית לתיקון חיתוך. מכיוון שמכשיר ה-quantitative real-time PCR אינו משמש בדרך כלל כפלורומטר, שנו את שיטת ההרצה במכשיר ה-quantitative real-time PCR לאיסוף נתונים מדי 20 seconds בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 180 cycles לפחות.

לאחר מכן, בכל 20 שניות למשך 15 מחזורים בفلורסצנציה המקסימלית של ה-molecular beacon כדי לקבל נתונים לצורך נורמליזציה. הגדירו את נפח התגובה ל-25 microliters. לאחר מכן, הגדירו את תכנון הפלטה במכשיר באמצעות תוכנת applied biosystem, כאשר סוג הניסוי הנבחר הוא standard curve, והשלימו את פריסת הפלטה.

דוגמה מוצגת בטבלה זו, שניתן למצוא גם במסמך המצורף. אין להוסיף דבר לבאר שנבחרה כעקומת התקן. הניחו על קרח את תחליל התגובה של basic excision repair, DTT, ליסאט תאים בריכוז של 2 µg/µL ואת כל ה-molecular beacons המשמשים בניסוי.

לאחר מכן, הוסיפו DTT לתמיסות התגובה של תיקון בחיתוך בסיסי (basic excision repair) עד לריכוז סופי של 1 mM. העבירו בפיפטה 15 µL של תמיסות התגובה של תיקון בחיתוך בסיסי עם DTT לכל באר בלוח optical Q-R-T-P-C-R תואם, על קרח. לאחר מכן, בהתאם למבנה הלוח, העבירו בפיפטה את ה-beacons לבארי המתאימים.

יש לבצע בדיקה של כל שילוב של ליזט עם ה-molecular beacon או הבקרה בשלוש חזרות. לבסוף, יש להעביר בפיפט 5 µL של הליזט הגרעיני המדולל לכל באור רלוונטי. חשוב לזכור לשמור על כל ריאגנטי ה-molecular beacon קרים ולהעביר את הליזטים ללוחית כשלב האחרון.

זכרו כי הליזאטים מכילים חלבונים פעילים, והם יתחילו לתקן את ה-molecular beacons ברגע שיועברו בפיפטה לתערובת התגובה. לכן, חשוב מאוד לשמור על כל הרכיבים קרים כדי למזער את כמות תיקון ה-beacons המתרחשת לפני תחילת המדידות. לאחר הוספת כל הרכיבים, אטמו את הפלטה באמצעות סרט דביק אופטי (optical adhesive film) וערבבו על ידי טפיחה עדינה על הפלטה.

לאחר מכן, בצעו ספינט קצר של עשר שניות בצנטריפוגה כדי לרכז את התמיסות בתחתית המבחנות או הפלטה. לאחר הספינט, הכניסו את הפלטה למכשיר ה-quantitative realtime PCR והתחילו את הבדיקה. עם סיום התהליך, ייצאו את הנתונים הגולמיים, רצוי בפורמט Excel, ופעלו לפי ההנחיות במסמך המצורף לניתוח הנתונים לאחר ביצוע החישובים הנדרשים. שרטטו את נתוני הפלואורסנציה הנורמליים כאחוז fam חופשי אל מול זמן בשניות בגרף פיזור עם השגיאות המתאימות, כדי להעריך את פעילות תיקון ה-DNA ואת איכות התמציות הגרעיניות מתאי LN 4 28 ומקו תאים עם ביטוי יתר של MPG המכונה LN 4 28 MPG. הבדיקה המתוארת בסרטון זה בוצעה באמצעות molecular beacon המכיל את סובסטרט ה-APE one tetra furin כביקורת חיובית.

כפי שמוצג באיור זה, לשני קווי התאים יש פעילות APE 1 חזקה, כפי שמעידה השיפוע התלול, ופעילות DNA glycosylase ספציפית להסרת סובסטרט MPG. רמות Hypoxanthine, המסומנות כ-HX, נמדדו בליזאטים גרעיניים משני קווי התאים. כל ליזאט נותח באמצעות beacon מולקולרי לבקרת תיקון חיתוך בסיס (base excision repair) או beacon מולקולרי HX לתיקון חיתוך בסיס; עבור ה-beacon של הבקרה, LN 4 28 מוצג בירוק, ועבור ה-beacon של ה-hypo מוצג LN 4 28 MPG בסגול.

LN 4 28 מוצג בכחול ו-LN 4 28 MPG מוצג בכתום. התוצאות מדווחות כ-A יחידות פלואורסצנציה ממוצעות ו-B, פלואורסצנציה מנורמלת. בכל תא התרחשה עלייה בפלואורסצנציה התלויה בזמן, המעידה על תיקון HX.

הליזאט דגרא בנקוביה עם ה-HX molecular beacon כפי שצפוי. קו התאים LN 4 28 MPG, המסומן בעקבה הכתום, הראה קצב תיקון גבוה בהרבה, כפי שמעידה הצטברות הפלואורסצנציה המהירה יותר, מאשר קו התאים ההורי LN 4 28, שבו רמת חלבון ה-MPG מינימלית. לפיכך, ניתן למדוד בזמן אמת את קצב התיקון של נגעים ספציפיים ב-DNA על ידי חלבוני תיקון ספציפיים מתוך תמציות תאים, עם רמות רקע מינימליות של שבירה לא ספציפית של DNA.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי תכנון Molecular beacons ומדידת שיעורי תיקון DNA בזמן אמת, תוך שימוש בחלבונים מטוהרים או בליסאטים של תאים. בנוגע לניתוח, חיוני להעריך את הטווח הדינמי ואת ערכי הרקע, ועושים זאת על ידי הכללת תגובות ביקורת, כגון עם או ללא ה-beacons של הביקורות החיוביות והשליליות. בהתחשב בשונות שבין הבארים, מומלץ לנרמל את הנתונים בבארים הבודדות ביחס לערכי הקלט.

אלו נקבעים על ידי השלב המדויק יותר בטמפרטורת ההמסה. דבר זה, יחד עם הכללת צבעים נוספים כמו צבע סלע, יפחית את השונות הגלומה לשגיאות פיפיה או להבדלים בגלאים. טכניקה זו אפשרה לנו להגדיר את השפעתם של רכיבי תיקון של חיתוך בסיס (base excision repair) בודדים על הפעילות והקיבולת הכללית של התיקון.

הוא רגיש מספיק כדי לחשוף שינויים קטנים שלא היו ניתנים לגילוי בשיטות קונבנציונליות.