אתר ספציפי הנדסה כרומוזום בקטריאלי: ΦC31 מתווכת integrase קלטת Exchange (IMCE)

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לשלב מבנה DNA רצוי בכרומוזום החיידקי בלוכוס שנקבע מראש. דבר זה מושג באמצעות פרוטוקול הזדווגות הכולל ארבעה זנקי חיידקים מהונדסים. לזנק המקבל יש רצף "landing pad" המורכב מגן עמיד לספקמיצין ומגן e coli beta glucuronidase, המוקפים באתרים של ATP ששולבו בכרומוזום שלו.

זן התורם P JH one 10 נושא פלסמיד המכיל אתרי B המקיפים גן "stuffer" של חלבון פלואורסצנטי אדום, וגן לעמידות לאנטיביוטיקה. זן התורם PJC two נושא פלסמיד המכיל את האינטגרז הספציפי לאתר מהפאג C 31 של streptomyces תחת בקרתו של פרומוטר LAC. הזן הרביעי, MT 616, מספק את גני ההעברה הדרושים לקוניוגציה – העברת פלסמידים מתא לתא, אשר מביאה ליצירת טרנסגנים דרך זני המקבל.

השגת שני הפלסמידים הדרושים להחלפת קסטה המתווכת על ידי אינטגראזה. ההחלפה של קסטת התורמה מהפלסמיד PJ H one 10 עם הסמנים של קסטת נחיתת המטרה (landing pad) על הכרומוזום גורמת לאובדן סמני נחיתת המטרה, SPR ו-UIDA, ולשימור קסטת התורמה RFP ו-GMR בטרנס-אימיגראנט המתקבל. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כמו רקומבינציה הומולוגית, הוא הפשטות והיעילות של הפרוטוקול.

הוא ניתן להעברה גם למגוון רחב של חיידקים. זן המקבל המשמש בסרטון זה הוא זן S. milli latte. יומיים לפני הליך ההזדווגון ליצירת trans integrins, יש להעביר מושבה בודדת אל תוך 5 mL של מצע TY עם spect mycin. יש לדגור את זן ה-S. milli בטמפרטורה של 30 °C למשך יומיים עם ניעור. ביום שלפני הליך ההזדווגון, יש להעביר כל אחד מזני ה-e coli הבאים אל תוך 5 mL של מצע LB נוזלי בתוספת האנטיביוטיקה המתאימה: DH5α המכיל את פלסמיד ביטוי האינטגראז למצע עם tetracycline; את MT616, המובליזטור, למצע עם chloramphenicol; ואת DH5α המכיל את פלסמיד קסטת התורם למצע עם Gentamycin. יש לדגור את שלושת זני ה-e coli למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור קבוע. כדי להכין את התאים להליך ההזדווגון, העבירו 1.5 mL מכל אחת מארבע התרביות לשפופרה וסבבו בצנטריפוגה ב-17,000 ×g למשך 30 שניות לאיסוף משק התאים. השליכו את המצע והשעיכו מחדש כל משק תאים ב-1 mL של 0.85% sodium chloride סטרילי. סבבו את השפופרות שוב בצנטריפוגה, ולאחר השלכת הנוזל העליון, השעיכו מחדש כל משק ב-100 µL של 0.85% sodium chloride סטרילי. בעזרת פיפטה, טפטפו באופן פרטני 10 µL מתרבית שטופה של כל זן על פלטת TY agar רגילה.

נקודות אלו הן נקודות בקרה. לאחר מכן, העבירו 40 µL מכל זן, למעט e coli DH5α המכיל Pjc2, למבחנה סטרילית וערבבו באמצעות פיפטינג מעלה ומטה; טפטפו 120 µL מתערובת זו על פנית TY agar חלקה. נקודה זו היא בקרת השלילה ללא אינטגרז.

לבסוף, העבירו 40 µL מכל אחד מארבעת הזנקים לשפופרת ערבוב סטרילית וערבבו. טפטפו 160 µL מתערובת זו על אותה צלחת אגר TDY. נקודה זו היא נקודת ההזדווגות להחלפת קסטה בתיווך אינטגראז (integrase mediated cassette exchange).

הניחו את הפלטה במכסה זרימה למינרית והמתינו כ-20 דקות עד להתייבשות הנקודות. אטמו את הפלטה והדגרימו בטמפרטורה של 30 °C למשך לילה, יום לאחר ביצוע פרוטוקול הריסוס של ההשבחה. רססו את שתי נקודות הבקרה ואת נקודת ההשבחה של ה-IMCE על פלטות אגר TY המועשרות בסטרפტომייצין ובגנטמיצין.

זן המקבל S milli נושא מוטציה המקנה עמידות ברמה גבוהה לסטפטומייסין לצורך חישוב יעילות ה-IMCE. השביה בערבוב (Resus suspend) כרבע מנקודת ההזדווגות של ה-IMCE ב-500 microliters של 0.85% Sodium chloride סטרילי. בצע מהלולי דילול עשריים עד לדילול של 10 to the negative seventh. זרע את הדילוחיות מ-10 to the negative two ועד 10 to the negative five על מצעי TY agar המועשרו בסטפטומייסין, גנטמיצין ו-xgl כדי לבחור את התרנסימיגרנטים (trans immigrants). זרע את הדילוחיות מ-10 to the negative three ועד 10 to the negative seventh על מצעי TY agar המועשרו בסטפטומייסין ו-xgl כדי לבחור הן תרנסימיגרנטים והן מקבלים פוטנציאליים. סכום המקבלים הכולל (IE total recipients). דגור את המצעים בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך שלושה ימים.

צפו ב-RFP trans תחת אור ירוק ובאמצעות מסנן אדום; חשבו את אחוז יעילות ה-IMCE כ-CFU של trans immigrants בהשוואה ל-CFU של סך המקבלים. בערך מחצית מה-trans יעברו החלפה אמיתית, מה שיהפוך אותם ללבנים ולא רגישים לאחר שלושה ימי דגירה על TY המועשר בסטפטומייצין וגנטמיצין. לא אמורה להיות צמיחה בזני הבקרה הבאים: בקרת no integrase s milli latte UW 2 27, בקרת e coli MT 616, בקרת e coli DH five alpha המכילה P JH one 10, ובקרת e coli DH five alpha המכילה PJC two. בניגוד לכך, למריחת ה-IMCE מנקודת ההזדווגות צמיחה רציפה (confluent) במריחה הראשונית ומושבות רבות במריחה השנייה. שתי התמונות הבאות מראות תרחיפי resus של דילול 10⁻² של נקודת ההזדווגות על agar TY streptomycin xgl, ועל agar TY streptomycin Gentamycin xgl; על ה-TY streptomycin Gentamycin xgl agar.

המושבות הכחולות הן רקומביננטים בודדים. בעוד שהמושבות הלבנות הן טרנס-אינטגרינים שעברו החלפת קסטה אמיתית כאשר הם נצפים תחת אור ירוק ובמסננת אדומה, הרי שהדילול 10⁻² של תרחיף ה-resus של נקודת ההזבב על מצע TY strept cin xgl אינו מראה פלואורסצנציה. לעומת זאת, הדילול 10⁻² של תרחיף ה-resus של נקודת ההזבב על מצע Ty streptomycin Gentamycin Xgl מראה שתי רמות של פלואורסצנציה.

המושבות הבהירות יותר תואמות למושבות כחולות ובעלות ביטוי RFP גבוה יותר, ככל הנראה עקב קריאה רציפה (read through) מהפרומוטור LAC בווקטור. המושבות הפחות בהירות תואמות למושבות לבנות, שעברו החלפת קסטה אמיתית ומכילות את ה-RFP עם הפרומוטור המיידי שלו בלבד, ללא קריאה רציפה מהפרומוטור LAC. מגמות אלו אמורות להיות גם רגישות לספקטימיצין.

היעילות של השילוב הטרנסגני (trans integration), המבוטאת כאחוז המהגרים הטרנסגניים מכלל המקבלים, צריכה להיות בטווח של 0.5%. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי השימוש בקונג'וגציה חיידקית באמצעות הזנים ההנדסיים שלנו להחדרת מבני DNA לכרומוזום החיידקי.