פרי ניתוח נדיפים באמצעות האף האלקטרוני

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע ניתוח מהיר של תרכובות נדיפות בפרי. הדבר משיג תחילה על ידי חיתוך והומוגניזציה של רקמת הפרי. לאחר מכן, שלב האדים שמעל דגימת הנוזל מנותח באמצעות האף האלקטרוני.

בעקבות ניתוח באמצעות אף אלקטרוני, הנתונים מיוצאים ועוברים טרנספורמציה. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא זיהוי חלונות של מדד covas ואיחוד הפסים תחת תווית מדד covas אחת באמצעות הממשק הגרפי. בסופו של דבר, התוצאות מראות כי הבדלים בשכיחות של שקיות פרי (follicles), כפי שנמדדו באמצעות אף אלקטרוני, יכולים להיות קשורים לטיפולים ניסיוניים כגון זן הפרי, רמת הבשלות ואחסון.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון כרומטוגרפיה גזית מסורתית, הוא שהיא מאפשרת ניתוח מהיר יותר של תרכובות נדיפות בפירות. בעת ביצוע ניתוח זה, עשויים להתרחש שינויים קלים בזמני השהייה של האנליט. הדבר עלול להוביל לפירוש מוטעה של הנתונים ללא התחשבות קפדנית בתהליך יישור הפסגות.

לאחר קטיף הפירות בשלב הבשלות הרצוי, יש לשטוף אותם במי ברז. בחרו פירות לאנליזה, תוך הסרת לכלוך ואבק. בהתבסס על היעדר פגמים חיצוניים ופנימיים ועל אחידות הגודל, חתכו את הפירות לאורכן לפלחים לצורך דגימת חומרים נדיפים.

במידת הצורך, הסר זרעים מהקליפה, רקמה מחלל הזרעים או את הגלעין. בחירת הרקמה חייבת להיות עקבית לאורך כל הניסוי, ויש להביא בחשבון שונות בתוך פרי בודד. לדוגמה, יש לדגום באופן שווה מחלקים מהקוטב של הפרי (אזור הפריחה) ומקצה הגבעול.

שלבו את רקמת הפרי שנבחרה, ערבבו אותה כדי להבטיח אקראיות ולאחר מכן שקלו 200 גרם לתוך בלנדר מסחרי. הוסיפו 200 milliliters של תמיסת calcium chloride רוויה. ה-calcium chloride נועד לשמש כמעכב של פעילות אנזימטית, העשויה להתרחש לאחר חיתוך והומוגניזציה של בשר הפרי.

לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של תמיסה בריכוז 100 mM של two methyl butyl isoate במתנול. תמיסה זו מתווספת כסטנדרט פנימי כדי לנטר אובדנים אפשריים של תרכובות נדיפות במהלך תהליך ההומוגניזציה. לאחר מכן, בצעו הומוגניזציה לתערובת בבלנדר מעבדה למשך 30 שניות במהירות של 18,000 RPM.

לאחר מכן, שפכו מיד לבקבוקר זכוכית ואטמו בעזרת מכסה טפלוני. שמרו את ההומוגנאט בבקבוק עד להכנת כל הדגימות. העבירו באמצעות פיפטה מנות של 5 mL של מיץ ללא קצף למבחנות זכוכית קטנות (vials) בצבע ענבר בנפח 20 mL, תוך הכנת לפחות שלוש מבחנות עבור כל דגימה.

כדי שישמשו כחזרות טכניות. אטמו את המבחנות עם פקקי ברגי פלדה המצוידים במחיצות סיליקון טפלון. בשלב זה, ניתן לנתח את הדגימות באופן מיידי או להקפיאן בהקפאה מהירה בחנקן נוזלי ולאחסנן בטמפרטורה נמוכה במיוחד לצורך ניתוח מאוחר יותר.

טען את שיטת האנליזה המתאימה למכשיר ה-Xenos. הזן את הפרמטרים כפי שמופיעים בפרוטוקול הכתוב. חבר מחט מפל אל חלד עם קצה שאינו דוגם (non coring tip) לכניסה של ה-xenos.

נקה את המערכת מספר פעמים באמצעות אוויר סביבתי עד שהקו הבסיסי יהיה יציב ולא יזוהו שיאים הגדולים מ-200 counts. התכונן לכיוון המכשיר על ידי החדרת מחט למחיצה (septum) של בקבוקון המכיל תמיסה של straight chain acas כדי לשחרר את הלחץ. לאחר מכן, הכנס את המחט המחוברת לכניסת המכשיר אל תוך המחיצה.

בצע את הכיול על ידי הפעלת דגימה של המרחב העליון (headspace). תוצאת הכיול משמשת את תוכנת המכשיר להמרת זמן השהייה של הפסגות הרלוונטיות מיחידות זמן למדד covas או יחידות KI. כתוצאה מכך, לאחר כיול המערכת, זמני השהייה מדווחים ביחידות KI.

התחילו בניתוח הדגימה לאחר שיווי משקל של הדגימה למשך 30 דקות, על ידי החדרת המחטים אל הספטום של בקבוקון הדגימה. בצעו זאת כפי שנעשה עבור התמיסה של acas בעלי שרשרת ישרה. הפעילו את דגימת ה-headspace ידנית על ידי לחיצה על כפתור ההפעלה (play), מה שיגרום להפעלת המשאבה ולשאיבת האדים הנמצאים מעל הדגימה.

בסיום האנליזה, מופיע כרומטוגרם על המסך והחיישן מחומם באופן אוטומטי ל-150 °C למשך 10 שניות לצורך ניקויו. כאשר תיבת מצב המערכת הופכת שוב לירוקה, המכשיר מוכן לאנליזה של דגימה נוספת. כדי להבטיח קו בסיס (baseline) יציב וניקוי תקין של המערכת, יש להריץ לפחות ריקון אוויר (air blank) אחד בין כל דגימה.

נתחו לפחות שלושה שחזורים טכניים לכל דגימה, וכן בקרות של מבחנות ריקות (vial blanks). ייצאו את הנתונים לקובץ Microsoft Excel לאחר הרכישה באמצעות פונקציית ה-log stored data בתוכנת Mense. לאחר ייצוא הנתונים, הוסיפו עמודות המכילות תוויות עבור המשתנים והשחזורים.

ניתן להמיר את פורמט הנתונים המיוצא מתוכנת המכשיר לצורך מניפולציה קלה יותר באמצעות סקריפט Python 0.6 שנוצר במעבדה זו. שם קובץ המקור ושם הגיליון עבור נתוני הקלט, וכן שם הקובץ הרצוי לפלט, נערכים ישירות בתוך הסקריפט. סקריפט זה מקל על מניפולציה וניתוח של נתונים באמצעות זיהוי של kis ייחודיים בכל הדגימות.

הנתונים סודרים מחדש כך שמידע על הדגימות מופיע בשורות וערכי KIS ייחודיים בעמודות, כאשר כל תא מייצג את שטח הפסגה המתאים. אם לא זוהתה פסגה עבור ערך KI מסוים בדגימה, התא התואם נשאר ריק. לאחר מכן, באמצעות סקריפט שני שהופק מיבוא מעבדה זה, נעשה שימוש בנתונים מהקובץ שנערך בשלב הקודם.

הניתוח מבוסס על צפייה ובחינה של מספר הפעמים שבהם każdego ערך KI זוהה. לפיכך, התוכנית מציגה גרף עמודות של פגיעות KI. עבור כל ערך KI, העריך את פגיעות ה-K של תתי-קבוצות ספציפיות של דגימות, תוך ניתוח של כל קבוצת חזרות טכניות יחד.

כדי לעשות זאת, נתחו כל טיפול או משתנה בנפרד על ידי סימון או ביטול סימון של התיבות המתאימות. לאחר זיהוי הרוחב של כל חלון KI באמצעות הממשק הגרפי, בחרו באופן אקראי חלק מהכרומטוגרמות המתאימות. בתוכנת mense העריכו שיאים חופפים בין החזרות הטכניות.

לאחר זיהוי חלון ה-KI, נעשה שימוש בתכונת המיזוג (merge) בממשק הגרפי כדי למזג את ה-KIS הנופלים בתוך החלון אל ה-ki המאוכלס ביותר. לחצו על כפתור המיזוג כדי להפעיל את התכונה ובחרו את ה-ki המאוכלס ביותר במרכז החלון באמצעות לחיצה שמאלית על העמודה המתאימה. ברגע שהעמודה נבחרה, צבעה ישתנה לירוק; כדי למזג את ה-KIS הנופלים בתוך החלון אל ה-ki שנבחר, לחצו לחיצה ימנית על העמודות המתאימות.

פעולה זו גורמת לסרגים להפוך לאדומים, בעוד שסרג כחול באורך תואם מתווסף מעל ה-ki המרכזי. לאחר שכל ה-kis שנבחרו מוזגו לתוך ה-ki המרכזי המתאים, לחץ שנית על כפתור המיזוג כדי לאשר את השינויים. פעולה זו גורמת לכפתור המיזוג להפוך לצהוב במקרה של טעויות.

כפתור ביטול המיזוג (unmerge) זמין גם לביטול מיזוג. לחצו על כפתור ביטול המיזוג בממשק הגרפי. לאחר מכן, לחצו קליק ימני על הפס האדום שברצונכם לבטל את מיזוגו.

הפס הופך מאדום לכחול. לחץ שוב על כפתור ה-un merge כדי לקבל את השינויים. אם תנסה למזג באופן שגוי שני שיאים במדגם בודד לערך KI אחד, תודפס הודעת שגיאה.

לאחר שכל פעולות המיזוג נשמרו, יש לשמור את הקובץ לפני המעבר לניתוח סטטיסטי; הכרומטוגרמות של בלאנק האוויר ובלאנק הבקבוקים מנותחות כדי לנטר זיהומים אפשריים. ברגע שזוהו ה-ki של השיאים והבלאנקים, הפחיתו את שטח השיא שהתגלה בבלאנק האוויר ו/או בבלאנק הבקבוקים משטח השיא הקיים. בדגימה, האף האלקטרוני הצליח לזהות הבדלים בפרופילים הנדיפים בין פירות מלוני שנאספו בשלבי בשלות שונים.

מוצגים כאן דוגמאות לכרומטוגרמות מפירות בשלים מוקדם ומפירות בשלים לחלוטין, החושפות את ההבדלים בשטח הפסגאות. עבור מספר פסגאות רבות, זוהו חלונות של 20 K בכל הדגימות. ניתוח של השונות הראה כי מבין חלונות אלו, השפעות של 14 פסגאות שזוהו על ידי האף האלקטרוני השתנו באופן משמעותי בין שני שלבי הבשלות. כאן, שפע הפסגאות של הפירות הבשלים מוקדם עבור כל אחד מחלונות אלו מסומן בירוק, ושפע הפסגאות של הפירות הבשלים לחלוטין מסומן בכתום.

לאחר השלמת פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון כרומטוגרפיה של גזים בשילוב עם ספקטרומטריית מסות, במטרה לזהות את הרכיבים התואמים לפסגות בודדות באף האלקטרוני לאחר פיתוחו. טכניקה זו תספק כלי ניתוח מהיר ותאפשר לחוקרים בתחומי הפתולוגיה של צמחים, פיזיולוגיה של צמחים, ביולוגיה לאחר קטיף ומדעי המזון לבחון שינויים בהרכב החומרים הנדיפים בפירות כפונקציה של בשלות, זן או אחסון. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לנתח במהירות תרכובים נדיפים באמצעות אף אלקטרוני ולבצע יישור פסגות (peak alignment) באמצעות הממשק הגרפי שלנו.