הלהיטות מבוסס אינטראקציה הקרנת תאיים (AVEXIS) לאיתור Scalable זיקה נמוכה קולטן ליגנד אינטראקציות תאיים

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לגלות אינטראקציות חלבונות חוץ-תאיות חדשות המעורבות בתהליכי זיהוי תאיים, ובמיוחד חלבונים קולטנים המוטמעים בממברנה. גישת ה-AveXis נועדה לעקוף את זיקות האינטראקציה החלשות מאוד המאפיינות סוג זה של אינטראקציות חלבונים, ואת העובדה שחלבונים ממברנתיים קשים למניפולציה ביוכימית. דבר זה מושג תחילה על ידי בניית ספריית חלבונים רקומביננטית של האזורים החוץ-תאיים של קולטנים על פני השטח של התא.

דבר זה מושג על ידי תכנון פלסמידי ביטוי לייצור אזורי הדומיין האקטו של הקולטנים כפרגמנטים מסיסים, הן כפיתיונות (baits) מונומריים ביוטיניליים והן כטרפיים (prey) מסומנים באנזים פנטומרי. השלב השני הוא ביטוי ונורמליזציה של החלבונים כדי שיהיו מוכנים לסריקת אינטראקציות. כל החלבונים מופקים בתאי יונקים כדי להבטיח שתוספות של מודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות, כגון גשרי דיסולפיד וגליקוזילציה, יתווספו אליהם.

שלב מכריע בפרוטוקול הוא להבטיח שכל חלבוני הפיתיון (bait) והטרף (prey) בספרייה מנורמלים לרמות שמתחת לסף המוגדר. לאחר מכן מגיע החלק המרגש, סריקה לאיתור אינטראקציות חדשות. הפיתיונות מסודרים בבארות בודדות של פלטת מיקרוטיטר, ולאחר מכן נבדקים לאיתור אינטראקציות באמצעות הטרף.

לאחר מכן מבוצע שלב שטיפה. השלב הסופי הוא הוספת תסבסב (substrate) לאנזים כדי לזהות כל טרף שנלכד על מערכי חלבוני הפיתיון. בסופו של דבר, תוצאות של סריקת VEX יכולות להראות אילו רספטורים על פני השטח של התא מסוגלים ליצור שותפי קישור, ולכן עשויים להיות מעורבים בתהליכי הזיהוי והתקשורת בין תאים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות נפוצות להוצאת חלבונים, כגון שיטת השמרים ההיברידית (yeast two hybrid) או טהורים ביוכימיים, הוא שהיא תוכננה במיוחד לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון חוץ-תאיות. היא מתאימה במיוחד לגילוי אינטראקציות חדשות בין חלבוני קולטן מעוגנים לממברנה. קשה לזהות אינטראקציות אלו באמצעות טכניקות אחרות כיוון שחלבוני ממברנה קשים למניפולציה ביוכימית, ובדרך כלל האינטראקציות שלהם עם קולטני נגד הן חלשות ביותר.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מרכזיות הנוגעות לאופן שבו תאים מזהים זה את זה ומתקשרים ביניהם. ברמה המולקולרית, ניתן להשתמש בה כדי לענות על שאלות הקשורות לתהליכים ביולוגיים בסיסיים, כגון אילו חלבוני רספטור המוצגים על פני השטח של ביציות וזרעות נקשרו זה לזה, או אילו אינטראקציות בין רספטור לליגנד אחראיות להתנהגויות תאיות כגון היתוך מיוציטים או היווצרות רכס עצבי. האתגר העיקרי בגישה זו הוא בניית ספריות חלבונים מסוג bait and pray שבעזרתן ניתן לסרוק אינטראקציות.

חשוב מאוד לוודא גם שחלבוני הפיתיון (bait) והטרף (prey) מנורמלים בתוך רמות הסף הנדרשות לבדיקה. דבר זה מפחית את השכיחות של תוצאות שליליות שגויות וחיוביות שגויות. הרעיון לשיטה זו עלה לי לראשונה במהלך הדוקטורט שלי, כאשר ניסיתי לזהות שותף קישור לחלבון שטח התא CD 200.

בעצם, שאלתי את השאלה, מהי דפוס הקישור עבור קולטן שטח-תא ספציפי זה? אפילו כיום, זו נותרת שאלה שקשה לענות עליה מבחינה טכנית. עם זאת, באותו זמן, מיפוי הגנום האנושי היה קרוב להשלמה והבנתי שמאחר וכעת יש לנו רשימה מלאה של כל קולטני שטח-התא בגנום, נוכל כעת לשאול במקום זאת, מתוך קבוצה זו של חלבוני קולטן, אילו מהם יכולים להקיים אינטראקציה מבחינה טכנית.

זוהי שאלה שקל הרבה יותר לענות עליה, ו-AveXis הייתה השיטה שפיתחנו כדי להשיב לה. לאחר שהוקמה ספרייה של וקטורי פיתיון (bait) וטרף (prey) לביטוי, הכינו אותם לטרנספקציה לתאי HEC 2 9 3 E. התחילו בזריעת התאים ביום שלפני הטרנספקציה בצפיפות של 250,000 תאים למילליליטר ב-50 מיליליטר של מצע freestyle 2 9 3 כדי להבטיח ביוטינולציה יעילה. הוסיפו d biotin למצע המשמש לייצור חלבוני פיתיון, ולא לחלבוני טרף. לאחר הכנת כל הצלחות, דגרו את התאים למשך לילה בתנאים סטנדרטיים.

בשל מסיסות נמוכה של ביוטין והקושי בהכנת תמיסה מדויקת, אנו מעדיפים לשקול את הביוטין הנוסף, להוסיפו למצע ולאחר מכן לנער בחוזקה למחרת. בצע טרנספקציה ל-50 milliliters של תאי תרבית עם 25 micrograms של פלסמיד הפיתיון (bait) או הטרף (prey) באמצעות סוכן טרנספקציה מתאים כדי להפיק פיתיונות ביוטינליים. בצע טרנספקציה משותפת (cot transfect) של מבנה הפיתיון ביחס של 10 ל-1 עם פלסמידים המקודדים לצורה מופרשת של חלבון הליגאז של הביוטין ELI לכל קציר.

את התרביות חמישה ימים לאחר הטרנספקציה מעבדים תחילה על ידי שיקוע התאים בצנטריפוגה ב-3000 ×g למשך 20 דקות, ושנית על ידי סינון של supernatant דרך מסנן של 0.22 מיקרון. אחד המאפיינים המרכזיים של AveXis הוא שכיוון שחלבונים רקומביננטיים מופרשים, ניתן לדלל או לרכז אותם עד להשגת רמות פעילות ספיות. מצאנו שלחלבונים רקומביננטיים יש ביטוי משתנה עד ארבעה סדרי גודל, ולכן שלב הנורמליזציה מפחית את השכיחות של תוצאות חיוביות שגויות במהלך שלבי הסריקה.

כדי להתחיל בנורמליזציה של הפיתיון (bait), יש להסיר דה-ביוטין לא מצומד מהתווך באמצעות דיאליזה, כיוון שהוא יתחרה עם חלבון הפיתיון הביוטינולני על הקישור לאתרי הקישור של הסטרפטאווידין; התחל בקיבוע הפיתיון בתוך צינור דיאליזה. כדי להבטיח דיאליזה יעילה של החלבונים הרקומביננטיים, מצאנו כי חשוב לספק שטח פנים עודף של צינור הדיאליזה. בדרך כלל, אנו מספקים פי שניים עד שלושה יותר צינור ממה שנדרש בפועל עבור הנפח שעובר דיאליזה.

במשך 24 שעות, יש לבצע דיאליזה נרחבת של החלבון הפיתיון (bait) כנגד בופר מתאים כגון PBS לאחר ביצוע הדיאליזה. יש להתחיל את בדיקת ה-ELISA על ידי חסימה של בארות בלוחית מיקרוטיטרה מצופה בסטרפטאווידין באמצעות PBST המכיל BSA למשך 15 דקות. במקביל, על לוחית נקייה, יש להכין סדרה של ארבעה מהלולים ביחס של 1:3 של חלבוני הפיתיון ב-PBST עם 2% BSA.

לאחר דגירה של 15 דקות, העבר את הדילול לצלחת המקודדת strep TTR ודגור את הצלחת במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר שעה, שטוף את הבארות ולאחר מכן הוסף לכל בארה 100 µL של OX 68 בריכוז של 2 µg/mL. דגור את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה נוספת. לאחר הדגירה השנייה, בצע סדרת שטיפות נוספת וטען את הצלחת ב-anti-US alkaline phosphatase.

דגרו את הפלטה שעה שלישית בטמפרטורת החדר. כעת שטפו את הפלטה שלוש פעמים ב-PBST ובצעו שטיפה סופית ב-PBS. כדי להסיר שאריות דטרגנט, הוסיפו לאחר שעה 100 µL של תסבסב 1 0 4 בריכוז 1 mg/mL בבופר di ethanol amine.

בטמפרטורת החדר, מדדו את הבליעה באורך גל של 405 ננומטר. סדרת דילול של ארבעה סופנאטטים שונים של פיתיון שעברו דיאליזה זוהו באמצעות ELISA בעזרת נוגדן מונוקלונלי נגד תג CD4. אם חלבוני הפיתיון המבוטאים ללא דילול אינם מספיקים כדי להרוויח את כל אתרי קישור הביוטין של פלטה מצופה ב-strep avid ENC, רכזו את החלבון באמצעות Viva spin concentrator. אחרת, השתמשו בחלבון הפיתיון בריכוז מדולל ב-PBST עם 2% BSA.

כמות זו מספיקה בדיוק כדי להרוויע את אתר קישור הביוטין של הבדיקה. כמת את הרמות היחסיות שבהן מבוטאים החלבונים המקדימים (pre proteins) באמצעות פעילות אנזים ה-beta lactamase. התחל ביצירת סדרת דילול של התסנין המכיל את הפרפרוטאינים בבופר PBST 2%BSA.

לאחר מכן, הוסף 20 µL מהדילול ל-60 µL של תמיסת nitrous stepin שהועמסה בתוך פלטה. העבר מיד את הפלטה לקורא פלטות ומדוד את הבליעה באורך גל של 485 nm פעם בדקה למשך 20 הדקות הבאות, תוך שימוש במרכזים צנטריפוגליים או בדילול PBST עם 2% BSA. קבע את הריכוז הסופי של הדגימות כך שיעברו הידרוליזה של כל ה-nitros בבדיקה תוך כשבע דקות, שזהו קצב של כ-two ol nitros turnover לדקה.

התחל את סריקת ה-AveXis על ידי שטיפת פלטת strep TAVR ENC ב-PBST וייבוש הפלטה בטפיחות על נייר סופג. לאחר מכן, הוסף PBST עם BSA לכל באר והדגר את הפלטה למשך 30 דקות. פעולה זו חוסמת אתרי קישור שגויים של חלבונים.

מכל באער, יש להסיר את תמיסת החסימה באמצעות נטילת הפלטה בבת אחת מעל כיור, ולהוסיף 100 µL של פיתיון מונומרי ביוטיניליבי נורמליזד לבאערים המתאימים. יש להדגיר את הפלטה למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש להסיר את דגימות הפיתיון מהפלטה בנטילה נוספת ולשטוף אותה שלוש פעמים עם PBST.

לאחר מכן, ייבשו בטפיחות לאחר השטיפה השלישית. כעת, הוסיפו 100 µL של מבנה ה-prey הפנטמרי הנורמלי לכל באר והדגירו את הפלטה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. לאחר שעה, בצעו שלוש שטיפות נוספות של הפלטה עם PBST ושטיפה סופית עם PBS בלבד.

לבסוף, יש להוסיף 60 µL של תמיסת nitrous seven לכל באר ולהדגיר את הפלטה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים, או רצוי להדגיר את הפלטות למשך 16 שעות ב-4 °C. למחרת, אינטראקציות חיוביות יהפכו לאדומות. יש לצלם את הפלטה לצורך תיעוד ויזואלי ולאחר מכן לכמת את התגובות בבליעה של 485 nm באמצעות קורא פלטות.

כ-10 דקות לאחר תחילת תגובת הסריקה של AveXis, נצפו שינויי צבע מצהוב לאדום הן בביקורת ללכידת טרף המתווכת על ידי נוגדנים והן באינטראקציית הביקורת החיובית. שינוי צבע זה מעיד על הידרוליזה של תסבסבית הניטרוס. ניתן להבחין בחלק מהאינטראקציות החיוביות בפרק זמן זה, אך רובן הופיעו לאחר מספר שעות.

בדרך כלל, נצפה שיעור פגיעות של כ-0.4 עד 0.6% חיוביים. ברגע שספריות החלבונים מוכנות, ניתן לבצע את שלב הסריקה של טכניקה זו במהירות. ניתן לסרוק עד 12 פלטות ביום לאחר זיהוי אינטראקציה.

השלב הבא החשוב ביותר הוא להראות ראשית כי ניתן לשחזר את האינטראקציה באמצעות דגימות חלבון טריות ועצמאיות. שנית, אנו קובעים תמיד האם האינטראקציה אינה תלויה באוריינטציה של הפיתיון והטרף (bait prey), כלומר, האם ניתן להפוך ביניהם? תהליך זה כולל שיבוט של דומייני וקטור הפיתיון לתוך וקטור הטרף ולהיפך.

אינטראקציות שניתן לחזור עליהן ולהוכיח שהן הדדיות נחשבות לבעלות רמת ביטחון גבוהה, ותמיד הוכחו כחיוביות. באמצעות טכניקות אחרות כגון תהודה פלזמונית של פני השטח (surface plasma resonance), אנו נוהגים להשתמש בתהודה פלזמונית של פני השטח כדי לתקף באופן נוסף כל אינטראקציה שזיהינו מחדש. חשוב לציין כי הדבר מספק הוכחה לכך ששני הרכיבים המטוהרים יכולים להקיים אינטראקציה ישירה, וניתן להשתמש בכך גם כדי להראות שהקישור הוא רווי ולכן ספציפי.