שיטת צעד אחר צעד לכינונה מחדש של טרנספורטר ABC לחלקיקי ליפידים Nanodisc

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לשלב נשא מסוג A, b, C. במקרה זה, נשא המלטוז malf GK two, לתוך חלקיקי ננו-דיסק (nano disk) של ממברנה ממיסים. דבר זה מושג תחילה על ידי ערבוב חלבון פיגום הממברנה MSP, עם הנשא והכמות המתאימה של ליפידים במיסלים של דטרגנט.

השלב השני הוא הוספת חרוזי פוליסטירן וערבוב עדין של התערובת במנער (rocker) למשך הלילה; הדטרגנט נספג בהדרגה על גבי החרוזים, מה שמאפשר את היווצרות חלקיקי הננו-דיסק. לאחר מכן, החרוזים מוסרים באמצעות שיקוע. השלב הסופי הוא הפרדת הדיסקים שנוצרו כהלכה מאגרגטים ומחלבוני פיגום (scaffold proteins) שלא הורכבו, באמצעות כרומטוגרפיית סינון ג'ל.

לבסוף, איכות הדיסקים מוערכת באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל טבעי (native gel electrophoresis) או ספקטרוסקופיה של פיזור אור. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כגון ליפוזומים, הוא שחלבונים ממברנליים ודיסקים הם מסיסים לחלוטין בתמיסה מימית. בנוסף, הדומיינים החלבוניים נגישים כעת משני הצדדים.

מכיוון שכעת אין יותר מדור של ממברנה, תוך שימוש בחלבוני פיגום של ממברנה באורכים שונים, יכולתי ללכוד ולחקור את מצבי הרצועה השונים של חלבוני ממברנה. חשוב מכך, שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הפרוטאומיקה של ממברנות, כגון זיהוי של שותפי קישור חדשים של נשאי a, b, C. למעשה, ההשלכות של טכניקה זו משתרעות רחב יותר לעבר הטיפול הרפואי, שכן היא יכולה לסייע בגילוי של מפעילים או מעכבים של חלבוני ממברנה וקולטנים.

למרות ששיטה זו נראית פשוטה, יש לנקוט משנה זהירות בבחירת היחס הנכון בין החלבון לליפידים. בדרך כלל, מי שאינם בקיאים בשיטה זו מתקשים בחישוב היחס המולרי הנכון או בביצוע הבקרות המתאימות להבטחת איכות ההכנה. לפיכך, הדגמה חזותית של שיטה זו מועילה מאוד עבור סטודנטים חדשים ללימוד השלבים השונים והקשיים הפוטנציאליים.

כדי להתחיל, גדלו MSP עם תג hexa histidine בזן e coli BL 21 DE3 מהפלסמיד P MSSP 1D1; גרו את ייצור החלבון כאשר הצפיפות האופטית הנמדדת ב-600 nanometers היא כ-0.5 למשך שלוש שעות ב-37 degrees Celsius, ואספו את התאים על ידי סנטריפוגציה ב-5,000 Gs למשך 10 דקות ב-4 degrees Celsius. השעיו את המשקע בבופר TSG 10 המכיל 100 micromolar PMSF; פרקו את התאים באמצעות French press שלוש פעמים ב-8,000 PS.I. הסירו את החומר הבלתי מסיס על ידי סנטריפוגציה ב-5,000 Gs למשך 10 דקות ב-4 degrees Celsius. לאחר מכן, בודדו את הפракציה המסיסה המכילה את ה-MSP באמצעות אולטרסנטריפוגציה ב-125,000 Gs למשך 45 דקות.

טהרו את ה-MSP באמצעות כרומטוגרפיית ניקל קלטינג תוך שימוש ב-1.5 מיליליטר בערך של nickel seros high performance בבופר TSG 10. שטפו את המזהמים באמצעות בופר TSG 10 המכיל 50 millimolar ILE. לאחר דיאליזה, אלוטו את ה-MSP באמצעות בופר TSG 10 המכיל 600 millimolar I midaz.

ניתן לשמור את החלבון המטוהר בבופר TSG 10 MSP בטמפרטורה של 70- מעלות צלזיוס ובריכוז חלבון של כ-10 עד 15 mg/mL. קומפלקס MALF GK 2, בעל תג His בקצה ה-C של MAL K, מובע מהפלסמיד PED 22 FG K שגודל במאבקי e coli מסוג BL 21 DE 3. ייצור החלבון מופעל כאשר הצפיפות האופטית הנמדדת ב-600 nm היא כ-0.5, באמצעות 0.2% L-Arabs למשך שלוש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, לאחר ליזיס של התאים וסנטריפוגציה.

כפי שנעשה קודם לכן, נשעה את משקע הממברנה בבופר TSG 20 עד לריכוז סופי של חמישה מיליגרם למילליטר. לאחר מכן, נמיס את החומר בעזרת GDM בריכוז 1% משקל לנפח למשך שלוש שעות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עם ניעור עדין. נסיר את החומר הבלתי מסיס באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה, כפי שבוצע בניקוי של MAL FTK two.

לאחר מכן, אספו את העליון (supernatant) המכיל את קומפלקס mal FTK two המומס, וטהרו אותו שוב באמצעות כרומטוגרפיית ניקל קלטורית. טהרו את הקומפלקס עוד יותר באמצעות כרומטוגרפיית סינון ג'ל (gel filtration chromatography) בבופר TSGD בעזרת עמודה מסוג SUEx 200, HR ten three hundred בקצב זרימה של 0.5 milliliters per minute. להכנת פוספוליפידים, תמצית ליפידים כוללת של e coli המומסת בכלורופורם מופרדת ל-1000 מנות של anomal בשפופרות מיקרו-צנטריפוגה עם פקק הברגה; אידו את הממס תחת זרם עדין של חנקן ויבשו עוד יותר למשך לילה בוואקום.

ייבשו כעת, המיסו את שכבת השומנים בבופר TS בריכוז סופי של five NMO, ערבלו במיקסר (vortex) בעוצמה ולאחר מכן בצעו סוניקציה בפולסים חמש פעמים למשך כחמש שניות. השומנים המומסים ייראו עכורים מעט בשל חוסר המסיסות הכללי שלהם בבופר TS מימי, אך הם צריכים להישאר בתמיסה. הוסיפו DDM עד לריכוז סופי של 0.5%. בשלב זה, התמיסה תהפוך שקופה; הניחו את תערובת השומנים במקלח מים ובצעו סוניקציה בפולסים חמש פעמים למשך כחמש שניות.

ניתן לשמור את תערובת הליפידים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שבוע לכל היותר. להכנת ה-bio beads, העבירו כ-10 עד 15 milliliters של bio beads למבחנה של 50 milliliter. ראשית, שטפו את החרוזיים ב-50 milliliters של 100%methanol.

הניחו לחרוזים לשקוע בכבידה ולאחר מכן שפכו בעדינות את התמיסה. חזרו על התהליך פעם אחת עם methanol, ולאחר מכן פעמיים עבור 95%Ethanol, מי milli Q ובסוף TS buffer. התחילו את ה-nano discrete constitution על ידי דילול של MSP ב-TSGD buffer לריכוז סופי של כ-7 mg/mL או 0.3 mM.

כדי להבטיח ניסוי מוצלח, חשוב לבחור את היחסים הנכונים של הליפידים והחלבונים שיעורבבו יחד. ערבבו בערך two M של purified malf GK two complex ביחס של חלבון ל-MS P לליפיד של 1:3:60 בבफर TSGD לנפח סופי של 300 µL. כאן, מוכנה גם דגימה של עודף ליפידים ביחס של 1:3:400 כביקורת שלילית. הוסיפו למבחנה 50 µL של תמיסת bio bead והדגרירו את התערובת למשך לילה על שולחן נדנדה בטמפרטורה של 4 °C. למחרת, שקיעו את החרוזים באמצעות כבידה. לאחר שהחרוזים שקעו, שאבו את התמיסה באמצעות טיפ צר כדי להימנע ככל האפשר מהסעת bio beads.

הסר משקעים גדולים באמצעות אולטראצנטריפוגציה ב-100,000 GS למשך 20 דקות. המשך בטיהור הדיסקים באמצעות כרומטוגרפיית סינון ג'ל כפי שבוצע קודם לכן בבופר TSG 10. לאחר מכן, הזרק Eloqua לאותה עמודת סינון ג'ל כדי לבחון את יציבות התכשיר.

לאחר מכן, אגדו את הפראקציות המכילות את הדיסקים. את איכות ההכנה מעריכים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל נטיבי (native gel electrophoresis). נתחו ריכוז של one micromolar של ננו-דיסקים כדי להעריך את איכות השחזור.

העריכו גם את קישור ה-mal E למתחם mal ftk two ששוחזר בתוך ננו-דיסקים. לאחר אלקטרופורזה, צבעו את הג'ל ב-kumasi blue למשך 10 דקות ובצעו הסרת צבע למשך כשעה. לביצוע פיזור אור דינמי או DLS, טהרו תחילה את הננו-דיסקים באמצעות כרומטוגרפיית סינון ג'ל כפי שנעשה קודם לכן, תוך שימוש בעמודה מסוג SUEx 200 HR ten three hundred בקצב זרימה של 0.1 milliliters per minute.

אגדו את הפראקציות המכילות nano discs, ורכזו אותן לכ-10 mg/mL באמצעות מסנן צנטריפוגי AmCon. לאחר מכן, סננו את הדגימה פעמיים. בצעו ניתוח בשיטת DLS באמצעות מכשיר dynapro nano star בנפח פנימי של 1 µL בכוורית קוורץ (quartz cuvette).

באמצעות תוכנה דינמית להערכת הקוטר והמשקל המולקולרי של החלקיקים, קבעו את פעילות ה-ATPase של דיסקים ננומטריים משוחזרים של mal FTK 2 באמצעות בדיקה כולורמטרית. ראשית, ערבבו 1 µM של דיסקים מטוהרים ו-1 mM של ATP עם כמויות עולות של mal e. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות.

לאחר מכן, מדדו את שחרור הפוספט anorganic באורך גל של 660 ננומטר. השוו את כמות הפוספט ששוחחר לעקומת סטנדרט שהופקה באמצעות תמיסת סטנדרט של זרחן. את הnano discs מטהרים באמצעות כרומטוגרפיית סינון ג'ל.

הכרומטוגרמה מראה כי רוב הדיסקים שהורכבו מחדש נשטפים כפיסגה בודדת, בעוד שדיסקים שהוכנו עם עודף ליפידים נשטפים בנפח המת >, וכסדרה של פיסגות רחבות; איכות הכנת הדיסקים נותחית בהמשך באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל נטיב (native gel electrophoresis) – דיסקים שהורכבו מחדש עם כמות מוגבלת של ליפידים נעים כפס רחב וחד בג'ל הנטיב, בעוד שאלו שהורכבו מחדש בנוכחות עודף ליפידים נעים כמריחות. ניתוח באמצעות DLS מראה כי אוכלוסיית הדיסקים היא הומוגנית עם רדיוס ממוצע של 5.0 nanometers. בהתבסס על קירוב ה-DLS, לדיסקים שהורכבו מחדש יש משקל מולקולרי נראה של 215 kilodaltons; דגימות שהורכבו מחדש בנוכחות עודף ליפידים מציגות רדיוסים בעלי התפלגות רחבה סביב 100 nanometers, דבר האופייני לדגימות שאינן הומוגניות.

הפעילות של קומפלקס MAL FTK two מוערכת על ידי מדידת קצב הידרוליזת TP והזיקה לשותפים למעורבות כגון חלבון קושר המלטוז, MAL E. חלבון MAL E נקשר בזיקה גבוהה לנשא MAL FTK two באמצעותת אלקטרופורזה של ג'ל לא דנטורנטי. ניתן לזהות קומפלקס בין MAL E לבין MAL FTK two; כאן מוצגת העמדה של פעילות MAL KA TPA על ידי MAL E כפונקציה של ריכוז MAL E.

הכנת הננו-דיסק היא פשוטה יחסית, אך סטיות קטנות מהתנאים האופטימליים עלולות להוביל לצבירה (aggregation) בלתי הפיכה של חלבונים; לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בפחות משני ימים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור את חשיבות הבחירה ביחס נכון בין החלבון לליפידים, שכן כמות עודפת של ליפידים תוביל להיווצרות של חלקיקים גדולים דמויי ליפוזומים בעלי פולי-דיספרסיות. בשל כך, חיוני לנתח בקפידה את איכות החומר המשוחזר באמצעות טכניקות שאינן סינון ג'ל, כגון ספקטרוסקופיה של פיזור אור, אולטרה-צנטריפוגה אנליטית, או באופן פשוט יותר, אלקטרופורזה של ג'ל נטיבי (native gel electrophoresis).

זכרו, כי סוג הפוספוליפיד המרכיב את הדיסק, כמו גם סוג חלבון הפיגום של הממברנה (membrane scaffold protein), עשויים להשפיע על יעילות השחזור. לאחר צפייה בסרטון זה, אנו מקווים שקיבלתם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להפיק ננו-דיסקים ממיסים והומוגניים המכילים את חלבון הממברנה שבחרתם. בהצלחה בניסוייכם.