תגובת שרשרת פולימרז: פרוטוקול בסיסי פלוס אסטרטגיות לפתרון בעיות ואופטימיזציה
22 במאי 2012
PCR התפתחה טכניקה נפוצה הרבה מעבדות ביולוגיה מולקולרית. בתנאי הנה מדריך מהיר קונבנציונאלי פרוטוקולים מספר ה-PCR. כי כל תגובה היא ניסוי ייחודי, תנאים אופטימליים הנדרשים כדי לייצר מוצר להשתנות. הבנת המשתנים התגובה יהיה מאוד לשפר את יעילות לפתרון בעיות, ובכך להגדיל את הסיכוי להשיג את התוצאה הרצויה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים את השלבים המעורבים בתגובת שרשרת הפולימראז או PCR, המשמשת לייצור כמות מספקת של מקטע DNA ספציפי מכמות קטנה של חומר התחלתי. ראשית, יש להכין את הריאגנטים והחומרים שבהם ייעשה שימוש בתגובת ה-PCR, ולאחר מכן להכין את תערובת התגובה, הכוללת את ארבעת ה-deoxy ribonucleotides, את תבנית ה-DNA, את הפריימרים ואת ה-DNA polymerase. לאחר מכן, הגדירו את תנאי המחזור התרמי והפעילו את תגובת ה-PCR.
לאחר מכן, יש לבחון את התוצאות כדי לקבוע אם התגובה הצליחה. בסופו של דבר, תגובת שרשרת פולימראז אמורה להניב אמפליקון ספציפי בגודל המוצר הרצוי.
באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בפרוטוקול זה יתקשו מעט בהגדרת החישובים של כל אחד מהריאגנטים המשתנים, ולעיתים הם נתקלים בקשיים בפיפטינג ובנפחים הנכונים, במיוחד עם הפולימראז המכיל גליצרול. התחילו את הניסוי עם דלי קרח מלא וטרי. הרכיבו כפפות כדי למנוע זיהום של התגובה.
תערובת וריאגנטים. סדרו את רכיבי ה-PCR על קרח להפשרה מלאה. אלו כוללים את הפרימרים של תבנית ה-DNA, DNA polymerase, בופר תגובה 10 x עם או בלי מגנזיום כלוריד, דאוקסי-נוקלאוטידים, מים סטריליים ומגנזיום כלוריד.
מגנזיום כלוריד נדרש במידה ומשתמשים בבופר ללא מגנזיום כלוריד. הניחו פלטת 96 בארות בתוך דלי קרח כדי שתשמש כמעמד עבור מבחנות PCR בעלות דפנות דקות בנפח 0.2 milliliters. כעת הצטיידו במבחנות PCR ובמכסים על משטח העבודה.
מעמד לאنبובות PCR, טוש עמיד לאתנול וסט של מיקרופיפטים. יש להכין תמיד טבלת ריאגנטים המפרטת את תערובת התגובה עם כמות מדויקת של מים מזוקקים סטריליים כדי להגיע לנפח סופי של 50 µL. לדוגמה, שימוש ב-5 µL של בופר ללא מגנזיום, 1 µL של 10 mM dNTPs, ו-4.0 mM מגנזיום אופטימלי.
מיקרוליטר אחד מכל אחד מהפריימרים בריכוז 20 micromolar, 0.5 מיקרוליטר של תבנית בריכוז שני nanograms per microliter, ו-0.5 מיקרוליטר של פולימראז ידרשו 33 מיקרוליטר של מים סטריליים בלבד. יש להוסיף magnesium chloride אם הוא אינו נמצא בבופר 10x או אם הדבר נדרש לאופטימיזציה של ה-PCR.
המשיכו בסימון מבחנות ה-PCR באמצעות טוש עמיד באתנול על כל מבחנת תגובה. ראשית, הוסיפו את הכמויות המחושבות של מים סטריליים, לאחר מכן הוסיפו 10 x buffer ו-10 millimolar DN NTPs. בתגובה זו, אנו מבצעים טיטראציה עם מגנזיום כלוריד.
מכיוון שריכוז המגנזיום לא יהיה קבוע, מוסיפים מגנזיום כלוריד לכל מבחורת PCR בנפרד, ומביאים את הנפח ל-10 microliters באמצעות מים סטריליים, כך ש-40 microliters מהתערובת הראשית (master mix) הסופית מתווספים לכל מבחורת PCR. להשלמת תגובה של 50 microliter ומגנזיום כלוריד, המשיכו להוסיף את תבנית ה-DNA והפריימרים. לבסוף, הוסיפו 0.5 עד 2.5 יחידות של DNA polymerase לכל תגובה של 50 microliter במבחורת מיקרו-צנטריפוגה של 1.8 milliliter.
הכינו תמיסת master mix בכמות המספיקה לביצועי הבקרות וכן לפיצוי על איבוד חומר במהלך ההעברה בפיפט. כווןו מיקרו-פיפט לנפח של כחצי מסך נפח התמיסה וערבבו בעדינות באמצעות פיפוט. עבור כל דגימה לבדיקה, העבירו את ה-master mix לשפופרת PCR.
כעת, עבור ביקרת השלילה ללא DNA תבנית, הוסיפו את כל الريאגנטים והשתמשו במים סטריליים כדי לפצות על נפח ה-DNA החסר. לאחר מכן, עבור ביקרת החיוביות, השתמשו בסט של DNA תבנית ופריימרים המגבירים מקטע ידוע תחת אותם תנאים שבהם עובדים דגימות ה-PCR הניסיוניות. מכשירי ה-PCR (תרמוציקלרים) מחממים ומקררים במהירות את תערובת התגובה, מה שמאפשר דנטורציה של הדופלקס המושרית בחום, היבדרות (annealing) של הפריימרים לגדילים הפלוס והמינוס של ה-DNA התבנית והארכה של תוצר ה-PCR.
זמני המחזורים מבוססים על גודל התבנית ועל תכולת ה-GC של ה-DNA עבור הנוסחה הכללית. התחלו בדנטורציה ראשונית של התבנית, ולאחר מכן התניעו 25 עד 35 סבבים של תוכנית מחזורי טמפרטורה תלת-שלבית. השלב הראשון של מחזורים אלו נועד לדנטורציה של תבנית ה-DNA.
לאחר מכן, תכנתו עבור האופטימיזציה טמפרטורת התחלה (annealing) של הפריימרים שהיא נמוכה בכ-5 °C מטמפרטורת ההמסה (melting temperature) הנראית של הפריימרים, ולאחריה את שלב ההארכה (elongation) כדי להביא את הפולימראז לתבנית ה-DNA ולסנתז את תוצר ה-PCR. כעת הזינו את מספר המחזורים. תכנתו את השלב הבא.
שלב הארכה ממושך להשלמת הסינתזה של האמפליקונים. לבסוף, יש להוסיף שלב סיום הכולל קירור של התערובת ל-4 °C. אם תנאי PCR סטנדרטיים אינם מניבים את האמפליקון הרצוי, נדרשת אופטימיזציה של ה-PCR כדי להשיג תוצאות טובות יותר.
לכן, אם התגובות לא הצליחו בפעם הראשונה, כדאי לנסות לאתר את מקור התקלה בתגובה. ראשית, עליכם לוודא שהבעיה לא נבעה מטעות אנושית. דבר זה עלול לקרות במקרה של טעות בפיפוט או אם שכחתם להוסיף ריאגנט לאחת מכלים המבחנה.
בשלב הבא, ניתן לנסות לשנות חלק מתנאי המחמירות כדי להתאים את הגדרות התרמוציקלר, או לחלופין לשנות את ריכוז המגנזיום. ניתן גם לנסות להוסיף חומרים מסוימים לריאגנט כדי לפתור את הבעיות. כחלופה, שקלו שימוש ב-hot start PCR כשינוי ורסטילי שבו זמן הדנטורציה הראשוני מוארך באופן משמעותי.
לאחר מכן משתמשים באלקטרופורזה של ג'ל AROS כדי להפריד את תוצרי ה-PCR של הגן GAL three מ-DNA גנומי של S seia, במטרה לקבוע את ריכוז יוני המגנזיום האופטימלי עבור סט ריאגנטים זה; שימו לב, תוצר PCR בגודל הצפוי, 2098 base pairs, מופיע החל מריכוז מגנזיום של 2.5 millimolar, כאשר הריכוז האופטימלי הוא 4 millimolar. בהגברה של תבניות DNA שונות, השגת תוצר ה-PCR הרצוי כפס נפרד דורשת 2 millimolar מגנזיום. הפחתת מחומריות (stringency) התגובה לתנאי הגברה תת-אופטימליים למעשה גורמת להיווצרות של מריחה (smear) של תוצרי לא ספציפיים.
יתרה מכך, עם ההפחתה הכוללת של מחמירות התגובה, נדרשת כמות נמוכה יותר של יוני מגנזיום כדי ליצור אמפליקון. לפיכך, אופטימיזציה של ה-PCR תוך התחשבות במשתנים יכולה להניב את המוצר הרצוי באופן מובחן. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן ההקמה וההכנה של תגובת שרשרת פולימראז.
המטרה היא להבין את המשתנים של כל תגובת PCR וכיצד ניתן לתמרן אותם כדי ליצור את האמפליקון הרצוי.
סקירה כללית
מאמר זה מספק מדריך מקיף לטכניקת תגובת השרשרת של הפולימראז (PCR), ומפרט את השלבים הנדרשים להגברה מוצלחת של DNA. הוא מדגיש את החשיבות של הבנת משתני התגובה לצורך פתרון בעיות ואופטימיזציה של תוצאות ה-PCR.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה מולקולרית
- גנטיקה
- ביוטכנולוגיה
רקע
- PCR היא שיטה נפוצה להגברה של DNA.
- כל תגובת PCR היא ייחודית ודורשת תנאים ספציפיים.
- הבנת הרכיבים ותפקידיהם חיונית להצלחת התהליך.
- אתגרים נפוצים כוללים טעויות בפיפטינג וחישובים של ריאגנטים.
מטרת המחקר
- להדגים את השלבים המעורבים בהקמת תגובת PCR.
- לספק טיפים לפתרון בעיות עבור תקלות PCR נפוצות.
- להדגיש את החשיבות של אופטימיזציה של תנאי התגובה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של ריאגנטים וחומרים ל-PCR.
- הכנת תערובת התגובה עם נפחים מדויקים.
- תכנון תנאי המחזור התרמי להגברה של DNA.
- שימוש באלקטרופורזה של ג'ל לניתוח תוצרי ה-PCR.
תוצאות עיקריות
- הושגה הגברה מוצלחת של מקטעי DNA.
- אופטימיזציה של ריכוז יוני המגנזיום שיפרה את התוצאות.
- זוהו אסטרטגיות נפוצות לפתרון בעיות.
- הוכח כי שונות בתנאי התגובה משפיעה על התוצאות.
מסקנות
- הבנת רכיבי ה-PCR חיונית לפתרון בעיות יעיל.
- אופטימיזציה של התנאים יכולה לשפר משמעותית את הצלחת ה-PCR.
- ניסויים עתידיים צריכים להתמקד בליטוש הטכניקות להשגת תוצאות טובות יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
תגובת שרשרת הפולימראז (PCR) היא בסיסית לגילויים מולקולריים, והיא מאפשרת הגברה מדויקת של DNA מחומר מוצא מינימלי. הקמה חסונה של ה-PCR, פתרון בעיות ואופטימיזציה משפיעים ישירות על מהימנות הבדיקה, תיקוף המטרה והשחזור של זרימת העבודה בהמשך התהליך במחקר ופיתוח בביופארמה.&ד. שליטה במשתני ה-PCR ובבקרות חיונית עבור ביטחון חיזוי וקבלת החלטות מותאמת סיכונים לאורך צינורות הגילוי והשלבים הפרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ובפיתוח בביופארמה&D
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הגברה מהירה של מטרות גנטיות לצורך בדיקת השערות ובחינת מסלולים.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי הבטחת זיהוי DNA ספציפי וניתן לשחזור.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנוניים באמצעות מניפולציה מבוקרת של משתנים ופתרון בעיות.
- משפר את הביטחון החזיוי על ידי מזעור הגברה לא ספציפית וארטיפקטים ניסיוניים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק תבניות DNA מאושרות עבור פיתוח בדיקות וזרימות עבודה של סריקה בשלבים הבאים.
- מסטנדרט את תנאי התגובה כדי להבטיח שחזור ותוצאה כמותית בין סדרות שונות.
- מאפשר התרחבות ושימוש חוזר בפלטפורמה על ידי אופטימיזציה של רכיבי התגובה ופרמטרי המחזורים.
- תומך בהערכה מהימנה של תרכובות על ידי מזעור של תוצאות חיוביות שגויות הנובעות מתוצרים לא ספציפיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתכתב עם אסטרטגיות של סמני ביולוגים (biomarkers) תרגומיים על ידי אפשור זיהוי גנטי מדויק במודלים פרה-קליניים.
- מבטיח רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות פרוטוקולי הגברה חסונים.
- מפחית סיכון ביולוגי על ידי פתרון בעיות ואופטימיזציה עבור יעדים גנטיים הרלוונטיים למחלה.
- משפר את הפחתת הסיכונים החזויה (predictive de-risking) על ידי בקרה על שונות התגובה והספציפיות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטת ה-PCR ממוקמת בממשק שבין גילוי מוקדם, פיתוח בדיקות ומחקר פרה-קליני, ומשמשת ככלי חיוני לניתוח גנטי ולתיקוף מטרות (target validation).
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי מתן אפשרות להגברה ספציפית של DNA.
- סריקה: מספקת תבניות DNA מוכנות לבדיקה עם תוצרים כמותיים וניתנים לשחזור.
- אנליטיקה: מספקת קריאות ברורות להשוואת תנאים ניסויים ואופטימיזציה של משתנים.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלבי הגילוי לשלבים הפרה-קליניים על ידי תמיכה בהתאמת סמנים ביולוגיים (biomarkers) ותיקוף גנטי.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כיכולת סטנדרטית הניתנת לשימוש חוזר עבור יעדים גנטיים וזרימות עבודה מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בבדיקות גנטיות.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והסקילביליות של תהליכי הגברה של DNA.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות המשך (go/no-go) ויעילות הון על ידי מזעור הסיכון לכישלון ניסויי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף וקידום של מטרות גנטיות מותאמות סיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהכנת ריאגנטים, דיוק בפיפטינג ותכנות מחזורי תרמיים.
- דורש גישה למחזורי תרמיים (thermal cyclers) מכויילים, למערכות אלקטרופורזה של ג'ל ולתשתית אנליטית.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של הגדרות התגובה ושל פרוטוקולי פתרון בעיות.
- יש להתאים את אסטרטגיות האופטימיזציה לתבניות DNA ולסטים שונים של פריימרים.
- מגבלות מעשיות כוללות פוטנציאל לאמפליפיקציה לא ספציפית וצורך בפתרון בעיות איטרטיבי.
