טוען מדרדר עצבים, קטעי צליל, ושורשים השדרה עם צבעי ניאון

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להחדיר ריכוז גבוה של צבע פלואורסצנטי או צבע רגיש ליונים לנוירונים או לכל מסלול עצבי באמצעות טכניקה פשוטה וזולה. דבר זה מושג תחילה על ידי ייצור שני סוגים של פיפטות, סוג אחד וסוג שני. לאחר מכן, מחברים צינור אלסטומר גמיש לפיפטה מסוג אחד ומפעילים לחץ חיובי כדי לשאוב את המסלול העצבי המיועד אל תוך הפיפטה מסוג אחד, תוך וידוא שנוצר איטום תקין.

בשלב הבא, הכניסו את הפפית מסוג שני לתוך הפפית מסוג ראשון והשתמשו בפפית מסוג שני כדי לשאוב את שארית ה-A CSF מהפפית מסוג ראשון. לאחר מכן, הכניסו את הצבע לפפית מסוג ראשון, אך ודאו שלא נכנסו בועות אוויר. השלב הסופי הוא דגירה של הנוירונים בחושך למשך 6 עד 20 שעות.

בסופו של דבר, לאחר הסרת פיפטה מסוג אחת, הדגימה מוכנה למחקרי in vitro, מחקרים אלקטרופיזיולוגיים או מחקרים מורפולוגיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון יישום באמבט (bath application), הזרקת BOS ואלקטרופורציה, הוא שה-D מועבר לאוכלוסייה נוירונלית מוגדרת. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון פעילות, קישוריות, מורפולוגיה והפצה של נוירונים מוגדרים.

באופן כללי, הטכניקה דורשת תרגול, ובמיוחד הבטחה שהצבע לא ייהמר בתוך פיפט מסוג 1 ושלא יחדרו אליו בועות אוויר. התחילו את ההליך על ידי מתיחת צינור פוליאתילן מעל להבת מנורת אלכוהול כדי ליצור שתי פיפטות קצרות עם קצות מסתייגות. ראשית, מתחו פיפט קצרה מסוג 1 עם קצה קטן שיכול להחזיק בחוזקה את השורש או את המסלול המיועד.

בשלב הבא, קחו פיפט מסוג 2 בעלת מוט ארוך ודק יותר וקצה עדין מאוד שניתן להחדיר אל תוך הפיפט מסוג 1 עד לקצהה. לאחר מכן, חברו את הפיפט מסוג 2 למחט 19 gauge עם תפס EC. לאחר מכן, הנחו את חוט השדרה המבודד בתוך אמבט.

במהלך תהליך הטעינה, השתמש ב-A CSF מקורר כדי להבטיח ספיגה מלאה. לאחר מכן, הנח את פיפט מסוג 1 על תומך אלקטרודות, כך שניתן יהיה לחבר בקלות את הפתח האחורי שלו למזרק באמצעות צינור גמיש. בפרוצדורה זו, שלוף תחילה CSF אל תוך פיפט מסוג 1 באמצעות מזרק.

בשלב הבא, שאירו את המסלול האקסונלי או את השורש המיועדים למילוי. לאחר מכן, הסירו את הפיתול הגמיש מהפתח האחורי. לאחר מכן, חברו את הפ pipette מסוג 2 למזרק אחר.

הכנס אותה לפ pipette מסוג 1, המחזיקה מסלול אקסוני או שורש עצבי תחת המיקרוסקופ. השתמש במזרק המחובר ל-pipette מסוג 2 כדי לשאוב A CSF, כך שה-A CSF שנותר יכסה רק את המסלול האקסוני. לאחר מכן, הוצא את ה-pipette מסוג 2 מתוך ה-pipette מסוג 1.

עקבו אחר מפלס ה-A CSF למשך מספר דקות כדי לוודא אטימה טובה של המסלול האקסונלי או העצבים. לאחר מכן, המיסו את הצבע ב-A CSF או ב-0.2%Triton X 100 במים מזוקקים פעמיים. שאבו את התמיסה אל פיפטה מסוג 2 על ידי הפעלת לחץ שלילי חלש במזרק המחובר, תוך הקפדה לא לשאוב בועות אוויר.

כעת הכניסו את פיפטה מסוג 2 המכילה את הצבע אל תוך תמיסת ה-A CSF שנותרה. בפיפטה מסוג 1, שחררו לאט את הצבע אל תוך ה-A CSF תוך הפעלת לחץ חיובי עדין באמצעות המזרק. הקפידו לא להחדיר בועות אוויר ולא לגרום להעתקה של הרקמה המטרה מתוך קצה הטיפ. אם חודרת בועת אוויר לפיפטה מסוג 1 בזמן הזרקת הצבע, הוציאו את הבועה על ידי קירוב קצה פיפטה מסוג 2 אל הבועה, ולאחר מכן הפעלת לחץ שלילי חלש בעזרת המזרק המחובר.

לאחר ששוחררה כמות מספקת של צבע, הוצא את פיפטה מסוג שתיים. לאחר מכן, הדגר את הרקמה בחושך למשך שש עד 20 שעות, בהתאם לסוג הניסוי. לאחר שחלף זמן מספיק למילוי, משוך בעדינות את האלקטרודה מהרקמה.

לאחר מכן הרקמה מוכנה לדימוי או להיסטולוגיה. להלן תרשים סכמטי המראה טעינה סימולטנית של שלושה צבעים פלואורסצנטיים שונים המצומדים לדקסטראן אל נוירונים מוטוריים, נוירונים סנסוריים אפרנטים ונוירונים אינטרספינליים; נוירונים מוטוריים ונוירונים סנסוריים אפרנטים סקראליים מולאו באופן רטרוגרדי (backfilled) עם Cascade blue Dextran ו-Texas red dextran דרך השורשים הוונטרליים והדורסליים בהתאמה. דקסטראן פלואורסצנטי ירוק נטען לנוירונים אינטרספינליים שאקסוניהם עולים דרך ה-ventral funiculus.

מוצגת כאן תמונת קונפוקלית של חתך מהחוט השדרני הסקראלי שבו בוצע סימון רטרוגרדי (back labeling) של הנוירונים. שימו לב כי הסיבים התחושתיים האפרונטים המסומנים הם בעיקר איפסילטרליים. לצד מספר בלטות קונטרלטרליות, הנוירונים המוטוריים המסומנים הם איפסילטרליים לשורש הוונטרלי הממולא, בעוד שהנוירונים האינטרנוירונליים המסומנים הם קונטרלטרליים לו, כפי שמוצג על ידי ראש החץ.

בעקבות נוהל זה, ניתן לבצע שיטות נוספות במטרה לענות על שאלות מפתח כגון קישוריות תפקודית, מעממם מעכב, סוג סינוס, ההתפלגות וייצור מתווכי עצביים בנוירונים של שדה ה-DI. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הנוירופיזיולוגיה של חוט השדרה וגזע המוח לסמן אוכלוסיות נוירונליות ספציפיות באמצעות צבעים רגישים ליונים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן היישום של צבעים פלואורסצנטיים ו/או צבעים רגישים ליונים בנוירונים ובסיבים תחושתיים בחוט שדרה מבודד.