ביטוי חולף ואת סלולר לוקליזציה של חלבונים רקומביננטי תאים בתרבית חרקים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבטא חלבונים מתויגים פלואורסצנטיים בעלי עניין בתוך תאי חרקים זמינים מסחרית להבהרה משופרת של תפקוד החלבון ו/או סחר תאי של חלבונים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח המבוססות על ביולוגיה וביוכימיה של התא בנוגע לפונקציונליות החלבון, אינטראקציות חלבון ו/או לוקליזציה של חלבון תת-תאי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לייצר מבנים במהירות ולבטא חלבונים המוערכים תפקודית בתאים חיים ללא השפעות מזיקות הקשורות לביטוי נגיף הבקולו, ובכך לשפר את התפוקה.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה בחקר חלבוני חרקים, ניתן ליישם אותה גם על כל מערכת שעבורה רצוי לחקור את תפקוד החלבון או לוקליזציה תאית. מי שידגים את ההליך לתרבית תאי חרקים וטרנספקציה יהיה דני לרוי, טכנאי מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בהליך זה, הסר בקבוקונים של תאי SF9 ו-Tni קפואים מהמקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס ואפשר להם להפשיר באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר ההפשרה, יש לטהר את הבקבוקונים באתנול 70% ולהניח אותם על קרח. כל מניפולציות התאים הדורשות פתיחת בקבוקונים וצלוחיות תרבית רקמות חייבות להתבצע בתוך מכסה זרימה למינרי כדי לשמור על תנאים סטריליים. הוסף ארבעה מיליליטר של מדיום חרקים נטול סרום לבקבוק T25 חדש וארבעה מיליליטר של מדיום TNM-FH לבקבוק T25 נוסף.

העבירו מיליליטר אחד של תאי Tni מופשרים לבקבוק עם מדיום חרקים נטול סרום ומיליליטר אחד של תאי SF9 מופשרים לבקבוק עם מדיום TNM-FH. מניחים את הצלוחיות באינקובטור לא לח של 28 מעלות צלזיוס ומאפשרים לתאים להיצמד למשך 30 עד 45 דקות. החלף את מדיום הזריעה בחמישה מיליליטר מהמדיום המתאים.

והחזירו את הצלוחיות לחממה הלא לחה של 28 מעלות צלזיוס. עקוב אחר מפגש התאים מדי יום. מעבר התאים כשהם מגיעים למפגש של 90% כפי שמוצג על ידי תמונות מייצגות אלה.

הטה את הבקבוק המכיל את התאים המתכנסים כך שהמדיום יזרום לכיוון פינה אחת הרחק מהתא החד-שכבתי והשתמש בפיפטה סרולוגית סטרילית של חמישה מיליליטר כדי להסיר בזהירות את המדיום מבלי להפריע לתאים. עבור תאי Tni, השתמש בפיפטה סרולוגית סטרילית חדשה של חמישה מיליליטר כדי להוסיף בעדינות ארבעה מיליליטר של מדיום חרקים נטול סרום על השכבה החד-שכבתית המשולבת. העבירו את קצה הפיפטה על פני הבקבוק והשקו לאט כדי להסיר תאים המחוברים באופן רופף לתחתית הבקבוק.

כדי לבדוק את הניתוק המתאים של התאים, הסר את כל המדיה, הפוך את הבקבוק ושים לב שתחתית הבקבוק נקייה. עבור תאי SF9, הנצמדים חזק יותר, הוסף ארבעה מיליליטר של מדיום TNM-FH טרי והשתמש במגרד תאים כדי לעקור את התאים המחוברים. השתמש בפיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר כדי לערבב בעדינות ולהפחית את היווצרות התאים.

לאחר ניתוק התאים, העבירו כ-0.1 מיליליטר מכל תא ותערובת בינונית לצינור מיקרו-פוגה של 1.5 מיליליטר. בצינור מיקרו-פוגה נפרד של 0.5 מיליליטר הוסף 10 מיקרוליטר מכל תא ותערובת בינונית ל -10 מיקרוליטר טריפן כחול. הסר את שקופית תא מונה התאים מאריזתו והוסף 10 מיקרוליטר מתערובת הטריפן הכחולה הבינונית של התא לכל צד של שקופית הספירה.

הכנס את השקופית למונה תאים אוטומטי וקבע את צפיפות התא והכדאיות. העבירו בערך 1 עד 1.5 פעמים 10 לתאים השישיים לצלוחיות T25 עם מדיה טרייה. סמן את הצלוחיות עם שורת התא, התאריך, המדיום בשימוש, מספר התאים שנוספו ומספר המעבר.

מניחים את הצלוחיות באינקובטור של 28 מעלות צלזיוס עד 72 שעות. ההליך להעברת תאי חרקים חייב להתבצע גם בתוך מכסה זרימה למינר. זרע בקבוק T25 עם עד פעם אחת 10 לתאי Tni או SF9 ה-6 במדיום תא חרקים מתאים.

תאי Tni משמשים בהדגמה זו. גדל את התאים למפגש במשך 72 שעות בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס. 72 שעות לאחר מכן, הסר והשליך את המדיום הישן והוציא את תאי ה-Tni עם ארבעה מיליליטר של מדיום חרקים טרי ללא סרום כפי שהוצג קודם לכן.

ההיבט הקשה ביותר בהליך זה הוא השגת הצפיפות המתאימה של תאים המחוברים לכלי תחתית הזכוכית במהלך הטרנספקציה. אין להוסיף יותר משבע פעמים 10 לתא החמישי לכל מנה. לאחר שימוש במונה תאים אוטומטי כדי להעריך את צפיפות התאים, ערבבו היטב אך בעדינות את תרחיף התא על ידי היפוך הצינור והוסיפו בערך שבע פעמים 10 לתאים החמישיים לכלי זכוכית בודדים של 35 מילימטר.

אפשר לתאים להיצמד למשך 20 עד 25 דקות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס. עבור כל טרנספקציה, הוסף שני מיקרוגרם של DNA פלסמיד ל-0.1 מיליליטר של מדיום חרקים נטול סרום ללא FBS בצינור מיקרו-פוגה סטרילי של 1.5 מיליליטר. בצינור נפרד, מערבבים שמונה מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה עם 0.1 מיליליטר של מדיום חרקים נטול סרום.

לאחר מכן העבירו את התמיסה לצינור המכיל את ה-DNA של הפלסמיד המעניין. מערבולת קלה ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 20 עד 30 דקות. לאחר מכן, יש לדלל את תערובת טרנספקציית הפלסמיד עם 0.8 מיליליטר של מדיום חרקים נטול סרום, מה שמביא את הנפח הכולל למיליליטר אחד.

הסר בזהירות את המדיה מכלי הזכוכית המכיל תאים מחוברים. שכב על התאים המחוברים עם מדיום טרנספקציה פלסמיד מדולל. דגרו על התאים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך חמש שעות.

לאחר חמש שעות, הסר והשליך את מדיום הטרנספקציה ושטוף בעדינות את התאים עם מיליליטר אחד של מדיום חרקים נטול סרום, היזהר לא לעקור את התאים. מוסיפים שני מיליליטר של מדיום תאי חרקים טריים ללא סרום ודוגרים בחום של 28 מעלות צלזיוס למשך 48 עד 72 שעות. 48 עד 72 שעות לאחר העברת תאי החרקים, יש לשטוף את התאים פעם אחת עם מיליליטר אחד של מדיום חרקים IPL-41 ולאחר מכן לכסות בשני מיליליטר IPL-41 להדמיה.

הוסף ארבע טיפות של מגיב צביעת תאים חיים של Hoechst למדיום ודגירה בחום של 28 מעלות צלזיוס למשך 20 עד 25 דקות. הנח את צלחת ה-35 מילימטר לתוך המיקרוסקופ הקונפוקלי הסגור בלייזר. למרות שכלי זכוכית רבים זמינים מסחרית, חשוב שהם יתאימו לשלב המיקרוסקופ וייתכן שיהיה צורך לקבוע באופן אמפירי אילו כלי זכוכית תואמים ביותר לחיבור תאים.

התאם את המיקרוסקופ לתנאי התצפית של Hoechst, EGFP ו-mCherry. 359 ננומטר ו-461 ננומטר לעירור ופליטה של Hoechst. 489 ננומטר ו-510 ננומטר לעירור ופליטה של EGFP.

ו-580 ננומטר ו-610 ננומטר לעירור ופליטה של mCherry. באמצעות מטרה של פי 10, בצע סריקה ראשונית כדי לאשר ביטוי פלואורסצנטי. לאחר מכן, עבור למצב סריקה באמצעות מטרת טבילה במים עם ניגודיות פאזה של 60X.

התאם את עוצמת הלייזר, רגישות הגלאי, מהירות הסריקה, עומק ציר ה-Z והזום הדיגיטלי כדי לייעל את הניגודיות והרזולוציה של התמונה. דמיין את התאים בזום דיגיטלי של פי 1.5 כדי לתת הגברה כוללת של פי 90. שמור וייצא את הנתונים הגולמיים כקבצי תמונה TIFF לניתוח מאוחר יותר.

תאי Tni הועברו עם הפלסמידים המצוינים והביטוי של חלבונים רקומביננטיים הודגם באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית. טרנספקציה וביטוי מוצלחים של BtDrip1-EGFP רקומביננטי ניכרים על ידי נוכחות של פלואורסצנטיות ירוקה על פני התא. תאים שהועברו עם BtDrip2 גרסה אחת של EGFP מראים פלואורסצנטיות ירוקה בתוך מה שמצביע על הביטוי התוך-תאי של BtDrip2 גרסה אחת.

באופן דומה, תאים שעברו טרנספטציה עם PIB DmSPR-mCherry או PIB PLA2G15-mCherry מראים פלואורסצנטיות אדומה המציינת את ביטוי הכימרות המתאימות. בתמונות הממוזגות, האזורים הכתומים או הצהובים מצביעים על ביטוי של EGFP ו-mCherry כאחד, מה שמרמז על כך שהחלבונים ממוקמים במשותף בתוך אותם מבנים תת-תאיים. שכבת-על של תאים שעברו טרנספטציה כפולה עם PIB BtDrip1-EGFP ו-PIB DmSPR-mCherry מציעה לוקליזציה משותפת של BtDrip1-EGFP ו-DmSPR-mCherry על פני התא.

תאים שעברו טרנספטציה כפולה עם BtDrip2 גרסה אחת EGFP ו-PIB DmSPR-mCherry מראים מעט לוקליזציה משותפת של אותות פלואורסצנטיים ירוקים ואדומים המאשרים את הביטוי התוך-תאי של BtDrip2 גרסה אחת. לעומת זאת, הביטוי המשותף של PIB BtDrip2 גרסה אחת EGFP והסמן הליזוזומלי PIB PLA2G15-mCherry הביא לחפיפה משמעותית באותות הפלואורסצנטיים הציטופלזמיים, הירוקים והאדומים. זה מצביע על כך ש-BtDrip2 הוא תעבורה לליזוזומים בין-תאיים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבטא כימרות חלבון פלואורסצנטי בתוך תאי חרקים מתורבתים. מערכת זו מציעה בנייה וקטורית מהירה בסינתזת חלבונים, נמנעת מאתגרים של מערכות ביטוי מבוססות וירוסים, ומספקת אמצעי חזק לצפייה בחלבוני סחר בתאים.