מכרסם איי הערכת שכפול של התא פונקציה בטא Adenovirally-transduced מבודדים
25 ביוני 2012
פרוטוקול זה מאפשר לזהות את הגורמים לווסת את תפקודי התא המוני ביתא למצוא מטרות טיפוליות אפשריות לטיפול בסוכרת. פרוטוקול מורכבת השיטה יעילה להעריך איון שכפול של התא פונקציה בטא עכברוש איים מבודדים בעקבות מניפולציה של ביטוי גנים עם adenoviruses.
המטרה הכללית של הליך זה היא לזהות מסלולי שסוגנל המסדירים שינויים במסה התפקודית של תאי בטא. דבר זה ממושג באי-לטי (eyelets) מבודדים של חולדה על ידי ביטוי יתר או השתקה של ביטוי גן באמצעות וקטורים אדנו-ויראליים. לאחר מניפולציה זו, תפקוד תאי הבטא מוערך באמצעות הפרשת אינסולין, ושכפול האי-לטי נמדד על ידי שילוב של תימידין מסומן בטריטיום.
בסופו של דבר, בדיעות אלו יכולות להראות האם גן מסוים מווסת את השכפול ו/או את התפקוד של תאי בטא in vitro. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של העפעפיים, כגון האם רכיב מסוים של מסלול איתות משפיע על הצמיחה והתפקוד של תאי בטא? הכינו פלטה בעלת שש בארות שאינה מצופה לחלקו (non tissue culture coated) על ידי הוספת 2 mL של מצע גידול משופר למספר הבארות הדרוש.
לדוגמה, ניסוי טיפוסי עשוי לדרוש שלושה בארות, אחת לביקורת ללא וירוס, אחת לביקורת וירוס ואחת לקבוצת הניסוי; חממו את הפלטה ל-37 °C בתוך אינקובטור לתרביות רקמה למשך 30 דקות לפחות. מיד לאחר בידוד גלובולי העין של חולדה, הניחו בין 1 ל-200 גלובולים בכל אחת מהבארות של הפלטה שהוכנה. 60 גלובולים ישמשו לבדיקות ביוכימיות, ואת הגלובולים הנותרים ניתן להשתמש בהם למחקרי ביטוי גנים או ל-immunoblotting; נערו בעדינות את הפלטה כדי להביא את הגלובולים למרכז כל בארה.
לאחר מכן, טפטפו מיד את האדנו-וירוס ישירות על העיניות, במרכז הצלחת. השתמשו בריבוי זיהום (multiplicities of infection) של 1 עד 500, בהתאם ליעילות האדנו-וירוס בביטוי יתר או בהשתקת החלבון המבוקש.
חדירה יעילה של אדנו-וירוס לליבת העפעף מגבירה את עקביות התוצאות. חיוני לבצע את התעתוק (transduction) של העפפיים מיד לאחר בידוד העפעף.
אין להפריע לצלחת במשך חמש דקות, ולאחר מכן יש להעבירה לאינקובטור למשך 24 שעות. למחרת, הוצא את הצלחת מהאינקובטור ונפח בעדינות את העין-סיבים (eyelets) אל מרכזי הבארים. העבר את העין-סיבים לבאר חדשה המכילה מצע טרי באמצעות מיקרופיפט של 200 µL.
במידה והלולאות נצמדות ללוחית, ניתן לשחרר אותן בעדינות באמצעות קצה הפ pipette. מומלץ להשתמש בנגיף בקרה המבטא GFP כדי לוודא יעילות טרנסדוקציה מספקת, באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי להדמיית חדירת ה-adenovirus לתוך תרבית ליבת האיים. השאירו את האיים למשך יום עד שלושה ימים נוספים, תוך החלפת המצע מדי יום.
יש לאופטימיזציה את זמן התרבית באמצעות מחקרי פיילוט, והוא משתנה בהתאם למטרות הניסוי. במהלך 24 השעות האחרונות, יש להוסיף למצע תימידין טריטיומי בריכוז של one micro curie למיליליטר של מצע. תחילה, הכן 50 milliliters של SAB עבודה בתוך מבחנה קונית של 50 milliliters וחמם אותה במקלח מים של 37 °C.
העבירו בעזרת פיפטה 10 milliliters של SAB עבודה למבחנה קונית של 15 milliliter והוסיפו 66.8 microliters של D glucose בריכוז 2.5 molar. כדי להכין את ה-SAB עם ריכוז גלוקוז גבוה, הוסיפו 44.8 microliters של D glucose בריכוז 2.5 molar ל-40 milliliters שנותרו מה-SAB עבודה. להכנת ה-SAB עם ריכוז גלוקוז נמוך, סמנו תחילה שלוש מבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 1.7 milliliter.
עבור כל באער של פלטת שש הבאערים, הוסף מיליליטר אחד של PBS לכל מבחנה. אין לשכוח לפעול לפי הפרוטוקולים המוסדיים לטיפול וסילוק של העיניות הרדיואקטיביות. באמצעות סטריאוסקופ או מיקרוסקופ סטנדרטי, בחר והעבר 20 עיניות בגודל דומה לכל מבחנת מיקרו-צנטריפוגה.
לדוגמה, כל מבחנה עשויה להכיל חמש טבעות עין קטנות, 10 בינוניות וחמש גדולות. למרות שהתוצאות מנורמלות לתוכן החלבון הכולל בסוף הניסוי, קריטי להתאים את גודל טבעות העין בין הקבוצות. לאחר מתן זמן לטבעות העין לשקוע לתחתית המבחנה באמצעות כוח הכבידה או על ידי סבב צנטריפוגה, שאבו ושקלו את ה-PBS עם מיקרופיפטה, ולאחר מכן המשיכו בהכנת טבעות העין עבור הבדיקות הביוכימיות.
כדי להכין את האישליטים (eyelets) לבדיקת הפרשת אינסולין, יש להקפיל אותם תחילה באינקובציה מוקדמת עם SAB דל גלוקוז. לשם כך, הוסיפו 400 µL של SAB דל גלוקוז למבחנות והניחו אותן, כשהפקקים סגורים, בתוך אינקובטור לתרביות רקמה למשך 60 דקות. לאחר שעה, שאבו את ה-SAB דל גלוקוז ששימש לאינקובציה המוקדמת. כדי למדוד הפרשת אינסולין בסיסית, חזרו על הליך האינקובציה המוקדמת.
עם זאת, כדי למדוד הפרשת אינסולין מושרית, השתמש ב-400 microliters של SAB עם רמת גלוקוז גבוהה במקום SAB עם רמת גלוקוז נמוכה, וכבעבר, דגרי את האיליות למשך 60 דקות לאחר דגירה ב-SAB עם רמת גלוקוז גבוהה או נמוכה; שאב את ה-SAB עבור בדיקת ה-radio immunoassay לאינסולין, שתבוצע בהתאם לפרוטוקול היצרן. לאחר מכן, המשך לבדיקת שילוב תימידין (thymidine incorporation assay) תוך שימוש באותה קבוצה של איליות. התחל עם האיליות ששימשו זה עתה לבדיקת הפרשת האינסולין.
הוסיפו 1 mL של PBS והמתינו עד שהעיניות ישקעו בכוח הגרביטציה. לאחר מכן, שאבו את ה-PBS באמצעות מיקרופיפטה. השליכו את הנוזל וחזרו על שלב זה פעם נוספת.
בשלב הבא, הוסף 500 µL של חומצה טריכלורואצטית קרה מהקרח אל ה-eyelets והדג אותם בקרח למשך 30 דקות. סבב את המבחנות בצנטריפוגה בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, בצע שאיבה והסר את ה-TCA.
לאחר מכן, הוסיפו 80 µL של נתרן הידרוקסיד בריכוז 0.3 נורמלי והדריכו את העיןולטים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך דגירה זו, ערבבו את הדגימות במיקסר וורטקס בעוצמה למשך חמישה עד 10 שניות בכל 10 דקות. במקביל, הוסיפו 4 mL של תמיסת ספירה (counting cocktail) מסוג conno safe למבחנות ספירת ניצנוץ נוזלית בנפח 7 mL.
עם סיום הדגירה של ה-eyelets, העבירו 50 µL מה-eyelets למבחנת סינליגציה (scintillation tube). נערו קצרה את המבחנה הסגורה ומדדו את הרדיואקטיביות של הדגימות בעזרת מונה סינליגציה נוזלי (liquid scintillation counter). כמו כן, למדידת ריכוז החלבון, העבירו 10 µL מה-vilas לבדיקת חומצה ביונית (bionic acid assay) מסחרית ופעלו לפי הפרוטוקול של היצרן.
מאוחר יותר, במהלך ניתוח הנתונים, נרמלו את התוצאות לריכוז החלבון באמצעות הפרוטוקולים המתוארים. שכפול איליות ותפקוד תאי בטא. באיליות של חולדה, נמצא כי ביטוי יתר של גן היפותטי שש באמצעות אדנו-וירוס עודד באופן חזק את שכפול האיליותים מבלי לשנות את תפקוד תאי הבטא.
ביטוי מוגבר של גן שש, סינתזה מוגברת של DNA כפי שנמדדה על ידי שילוב תימידין, מכיוון שמרבית התאים באיסולט של עיני חולדה הם תאי בטא. ניסויים נוספים עשויים להראות כי עלייה זו בשילוב התימידין נובעת מעלייה בשכפול תאי בטא. בדיקת הפרשת האינסולין הדגימה כי הביטוי המוגבר של גן שש לא שינה את אחת מתפקודי הבטא המרכזיים — הפרשת אינסולין ברמות גלוקוז נמוכות וגבוהות.
העלייה בהפרשת האינסולין בריכוזי גלוקוז נמוכים וגבוהים משקפת את בריאותן של האיליות לאחר טיפול באדנו-וירוס. אם הגברת הביטוי של גן six הייתה פוגעת בתפקוד תאי הבטא, הדבר היה משתקף ככל הנראה בירידה בכמות האינסולין המופרשת בריכוזי גלוקוז גבוהים ומגערים. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו ניתן למדוד את שכפול תאי הבטא ואת הפרשת האינסולין כדי לקבוע אם גן מסוים משפיע על צמיחתם או תפקודם של תאי הבטא.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מאפשר זיהוי של מסלולי איתות המווסתים את מסת תאי הבטא התפקודית, דבר החיוני לטיפול בסוכרת. השיטה מעריכה את השכפול של האיים ואת תפקוד תאי הבטא באיים מבודדים של חולדה, באמצעות מניפולציה של ביטוי גנים באמצעות וקטורים אדנו-ויראליים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- אנדוקרינולוגיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- הבנת המסה של תאי בטא היא חיונית למחקר על סוכרת.
- איים של לבלב מבודדים מחולדה משמשים כמודל לחקר תפקודי תאי בטא.
- ניתן לבצע מניפולציה של ביטוי גנים כדי לחקור את השפעותיהם על תאי בטא.
- הפרשת אינסולין ושכפול איים הם מדדים מרכזיים לבריאות תאי בטא.
מטרת המחקר
- לזיהוי גורמים המווסתים את מסת תאי הבטא התפקודית.
- למציאת מטרות טיפוליות פוטנציאליות לטיפול בסוכרת.
- להערכת ההשפעה של גנים ספציפיים על השגחה ותפקוד של תאי בטא.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מניפולציה של ביטוי גנים באמצעות וקטורים אדנו-ויראליים.
- הערכה של תפקוד תאי בטא באמצעות מדידת הפרשת אינסולין.
- הערכה של שכפול איים באמצעות שילוב של תימידין מסומן בטריטיום.
- שימוש בלוח בעל שישה בארות ללא ציפוי לתרבית רקמה עבור הניסויים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי גנים ספציפיים המשפיעים על צמיחת תאי בטא.
- הדגמת הקשר בין ביטוי גנים לתפקוד תאי בטא.
- תובנות לגבי מסלולי איתות המשפיעים על מסת תאי הבטא.
- זיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות לסוכרת.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק גישה יעילה ללימוד ביולוגיה של תאי בטא.
- מניפולציה של ביטוי גנים יכולה לחשוף תובנות חשובות לגבי סוכרת.
- שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מרכזיות בתחום האנדוקרינולוגיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מניפולציה של ביטוי גנים באי-בדיות (islets) מבודדות של מכרסמים באמצעות וקטורים אדנו-ויראליים מאפשרת הערכה שיטית של מסלולים המווסתים את השכפול והתפקוד של תאי בטא, נקודת מפנה קריטית לגילוי טיפולים לסוכרת. גישה זו מספקת ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה על ידי הבחנה בין השפעות על proliferate של תאים לבין השפעות על הפרשת אינסולין. השיטה תומכת בהחלטות תיקי השקעות מותאמות סיכון על ידי הבהרה אם מטרות מועמדות מגבירות את מסת תאי הבטא מבלי לפגוע בתפקודם.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של תפקוד גנים מועמדים בצמיחת תאי בטא ובהפרשת אינסולין.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטית על ידי בידוד השפעות על השכפול לעומת התפקוד.
- מסייע בזיהוי מטרות המגדילות את מסת תאי הבטא התפקודית למחקרים על סוכרת.
- מספק מערכת מבוקרת להבהרת מסלולים ולבדיקת היפותזות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מקיים מודלים מאושרים של איים (islets) להערכה כמותית של תוצאות מניפולציה גנטית.
- מספק מדדי הפרשת אינסולין ושכפול הניתנים לשחזור לצורך סריקות המשך.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות נורמליזציה לתכולת חלבון ולאיים בעלי גודל תואם.
- מאפשר הערכה מהימנה של מטרות גנטיות לצורך סריקה נוספת של תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים בין ממצאים in vitro למנגנונים רלוונטיים למחלה בסוכרת.
- מספק רצף משלב תיקוף הגנים בשלב הגילוי ועד לתיעדוף מטרות בשלב הפרה-קלני.
- תומך בפיתוח ביומרקרים תרגומיים על ידי קישור השפעות גנים לתפוקות פונקציונליות.
- מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים באמצעות הבהרת השפעת המטרה הן על השכפול והן על התפקוד.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי כך שהיא מאפשרת תיקוף של מטרות בשלבים מוקדמים, הפחתת סיכונים מכניסטיים ופיתוח בדיקות למחקר על סוכרת.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקה מונחית-היפותזה של תפקוד גנים בשכפול תאי בטא והפרשת אינסולין.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך בדיקת מוכנות המסה והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות מנורמלות של סינתזת DNA והפרשת אינסולין להשוואה סטטיסטית חסונה.
- מחקר תרגומי: מגשר בין תיקוף גנים in vitro לבין נקודות סיום תפקודיות הרלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר להערכה שיטתית של מטרות גניות מרובות בביולוגיה של איים (islets).
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף מטרה ומפחית עמימות מכניסטית.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של מניפולציה גנטית והערכה תפקודית באי islets מבודדים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת התהליך (go/no-go) ומשפר את היעילות ההונית על ידי הבהרה מוקדמת של השפעות המטרה.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תיעדוף של מטרות המותאם לסיכון עבור קווי פיתוח טיפוליים לסוכרת.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בבידוד איים, טרנסדוקציה אדנו-ויראלית ובדיקות תפקודיות.
- מחייב גישה לתשתיות של תרבית רקמה, מיקרוסקופיה קונפוקלית וספירה של סינתילציה נזילה.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדנית של פרוטוקולי בדיקה ואסטרטגיות נורמליזציה בין צוותים.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של תהליכי העברת הווירוס ותנאי הבדיקה.
- שלבי הסימון הרדיואקטיבי וכמות החלבון מחייבים עמידה בפרוטוקולי הבטיחות המוסדיים.
