דוגמנות סרטן קוליטיס-Associated עם Azoxymethane (AOM) ונתרן סולפט dextran (DSS)

ביום אפס, הוזרק למייר azoxymethane או OM בשבוע שלאחר מכן. מי השתייה שלהם מוחלפים בתמיסה המכילה dextran sulfate sodium או DSS. בשבוע השלישי, העכברים מקבלים מים למשך השבועיים הבאים.

מחזור מים זה של DSS חוזר על עצמו פעמיים נוספות. לאחר מחזור ה-DSS השני, ניתן לבחון את העכברים לאיתור גידולים באמצעות אנדוסקופיה של השוקה.

לאחר שבוע 10, העכברים נשחטים והמעי הגס נאסף. המעי הגס נשטף ונפתח לאורכו. המעי הגס נבדק להערכת גודל הגידולים ומספרם.

ניתן להטמיע חתךlongitudinal של המעי הגס בשלישים ולהעבירו לאנליזה היסטולוגית. באמצעות מיקרוסקופיית אור ניתן לספור ולסווג גידולים. אנו מדגימים פרוטוקול שבו מתבצעת מתן של החומר הגנוטוקסי OM, ולאחריו שלושה מחזורים של החומר הפרו-דלקתי.

DSS גורם להיווצרות מהירה ועקבית של גידולי מעי הגס בעכברים, בעלי דמיון מורפולוגי ומולקולרי לאלו הנראים בסרטן המעי הגס הקשור לקוליטיס בבני אדם. סמנו את העכברים באופן פרטני באמצעות סימוני זנב או תיוג אוזן ביום אפס, רשמו בטבלה את משקל הבסיס של כל עכבר, ולאחר מכן מזריקו לכל עכבר תמיסה של 10 mg/kg של OM exercise. יש לנקוט זהירות בעבודה עם OM כיוון שמדובר בחומר גנוטוקסי. ביום השביעי, ספקו לעכברים תמיסת 2.5% DSS כמי השתייה שלהם לשבוע הבא. להכנת תמיסה זו, הוסיפו אבקת DSS למים מזוקקים וערבבו עד להמסה מלאה.

התמיסה מוכנה לאחר סינונה דרך מסנן Cellulose acetate של 0.2 micron. כדי להבטיח אספקה רציפה של תמיסת DSS למשך שבעה ימים, יש להחליף את ה-DSS מדי יומיים עד שלושה ימים.

לאחר תקופה זו, העבירו את הכלובים בחזרה למים למשך שבועיים. שקלו את העכברים פעמיים עד שלוש פעמים בשבוע ועקבו אחר דימומים רקטליים ושלשולים. עכברים עם גידולים גדולים עשויים לפתח זמנית פרולפס רקטלי, אם כי בדרך כלל הדבר אינו מפחית את אחוז ההישרדות.

ירידה במשקל ביחס לקו הבסיס משמשת כמדד עקיף לחומרת הקוליטיס. ניתן לצפות לירידה במשקל של עד 10% יחד עם שלשולים ודימומים רקטליים למשך יומיים עד שלושה ימים בשבוע שלאחר מחזור מלא של DSS. ניתן לבצע מחזור שני או שלישי של DSS כדי לאשר צמיחת גידול in vivo לפני ההקרבה.

מכיוון שמודל A-O-M-D-S-S הוא אמין למדי ביצירת גידולים, שלב זה בדרך כלל אינו נחוץ. יש להעריך רק מספר קטן של עכברים באמצעות שיטה זו, שכן היא עלולה לשבש את הגידולים בעכברים. אזור העבודה שלך צריך לכלול כוס כימית של תמיסת פוספט רב-ערכית סטרילית (PBS) וכן כוס כימית ריקה.

כדי להסיר PBS משומש, שאבו 8 עד 10 milliliters של PBS לתוך מזרק וחברו אותו לקצה האנדוסקופ עבור כל שימוש. לצורך שטיפת תכנים תוך-לומנליים, הרדימו כל עכבר באמצעות הרגעה בשאיפה או בהזרקה וקבעו את העכבר ללוח שטוח באמצעות סרט דביק בזנב ובחזה; ניתן לצבוט את כריות כפות הרגליים של העכבר. כדי להבטיח הרגעה מספקת, השתמשו באגודל ובאצבע המורה כדי לצבוט את הבטן התחתונה של העכבר לחשיפת פי התחת, והחדירו את אנדוסקופ muren לרקטום של העכבר.

יש להשתמש ב-PBS בעדינות כדי לנפח ולהשקות את המעי, במטרה לשפר את התצפית התוך-לומנלית ולהסיר תוכן צואי. יש להמשיך להחדיר את האנדוסקופ באיטיות תוך התבוננות במסך. לנוכחות של גידולים גסים ביום ה-70, כל עכבר שטופל ב-A-O-M-D-S-S אמור לשאת מספר גידולי מעי ולהיות מוכן להערכה.

ניתן לדחות מצב זה בשבועות עד חודשים אם מעוניינים בגידולים גדולים יותר. הכינו מזרק מלא ב-PBS המחובר למחט גavage. מזרק טעון ב-10% formalin, מספריים כירורגיים בסיסיים ומספריים בעלי קצוות מעוגלים.

מזרק קטן טעון בתמיסת 1%Ian Blue ופינצטה עדינה. כמו כן, הכינו מגש קר, סירת העברה המכילה PBSA מקורר, תער חדש לחיתוך וגיגית קיבוע מלאה ב-10%formalin. יש לבצע הרדמה של כל עכבר באמצעות isof, fluorine ופריקה צווארית או שיטה אחרת המאושרת על ידי המוסד. ניתן לבצע מדידת משקל סופית ומדידות אחרות.

בשלב זה, הניחו את העכבר על קרש חיתוך כאשר צדו הגחוני חשוף. רססו את הבטן ב-70% ethanol כדי למנוע מהפרווה להגיע לאזור הניתוח. השתמשו בפינצטה כדי לתפוס את קו האמצע של הבטן ובצעו חתך קטן דרך העור כדי לחשוף את הפריטונאום.

הפעיל מתיחה עדינה כדי להפריד את העור מהפריטונאום (Kuper's membrane) ולחשוף את כל חלל הבטן. בצע חתך בפריטונאום והרחב חתך זה לאורך השוליים הצלעיים משני הצדדים. השתמש במספריים סגורים כדי להזיז את המעי הדק והמעי הגס הצידה.

פעולה זו תחשוף את קשרי הלימפה המזנטריים, אותם ניתן לאסוף במידת הצורך. לצורך הערכה, הזיזו את דרכי השתן והמין כלפי מטה כדי לחשוף את המעי הגס היורד ואת הרקטום, והסִירו את שלפוחית השתן ואת איברי הרבייה ככל שנדרש כדי לחשוף עוד יותר את האגן. יש להיזהר לא לפגוע ברקמות סמוכות.

גזרו דרך הענפים הפוביים התחתון והעליון (inferior and superior pubic rami) כדי לחשוף את נקודת החיבור של פישרית המעי הגס והפישריט (anal rectal junction). גזרו את העור מסביב לחיבור זה כדי לשחרר את המעי הגס, תוך הפעלת מתיחה עדינה כלפי מעלה. באמצעות פינצטה מזנטרית (forceps mesenteric), ניתן להסיר או להפריד את ההיצמדוּת של המעי הגס.

חשוב לשמר חלק מהעור במעבר שבין פיס המעי הגס לפיס השבע, כיוון ששטח זה מושפע לעיתים קרובות מדיספלזיה. בצעו חיתוך של המעי הגס מהמעי הדק, מיד פרוקסימלית למעי העיוור (cecum). הפרידו את המעי העיוור מהמעי הגס הסמוך לו באמצעות מחט גavage בקוטר 18 gauge המחוברת למזרק של 5 mL.

שטפו את המעי הגס ב-PBS קר מאוד, כך שהנוזל ייצא בכיוון הפיזיולוגי, באמצעות מספריים עם קצוות מעוגלים. פתחו את המעי הגס לאורכו של המזנטריום. העבירו את המעי הגס הפתוח אל המגש הקר.

וודאו שהמגש הפשיר מספיק כדי לא להקפיא את הרקמה. מרחו מספר טיפות של 1%Ian Blue באמצעות אצבע כדי להקל על ויזואליזציית הגידולים. העריכו את מספר הגידולים ואת גודלם בעזרת סרגל, או צלמו תמונות לצורך ניתוח דיגיטלי.

בשלב זה ניתן להוציא מקטעים קטנים של הגידול ושל רקמה נורמלית סמוכה לצורך אנליזות עתידיות בשיטות של RNA, חלבון או אימונוהיסטוכימיה, תוך השארת חלק מהמעי הגס להערכה היסטולוגית. יש להחיל 10% formal על שאר המעי הגס במגש הקירור באמצעות מזרק או אצבע, ולאפשר לרקמה להיקבע למשך 30 seconds לפחות. באופן זה, תתאפשר העברה קלה יותר לאגן הקיבוע.

יש לוודא ששאריות פורמלין נגובות לפני צביעת מעי גס פתוח חדש על אותה תבנית. העבירו את המעי הגס לאגן מלא ב-10% formalin ונעצרו אותו בפינות באמצעות סיכות. לאחר שלוש שעות של קיבוע, השליכו את ה-formin והחליפו אותו ב-70% ethanol.

ניתן לשמר מעיים הגסים ב-70% ethanol ללא הגבלה. השתמשו בחום נמוך להכנת תמיסת 2% agar והניחו זכוכית למשקוק נקייה על פלטת זכוכית. חתכו את המעי הגס המקובע לשלישים והחזירו את החלקים שלא נעשה בהם שימוש לאגן ה-ethanol.

יש לקצץ את מקטעי המעי הגס לגודל אחיד באמצעות שני תערי. יש להטמיע את מקטעי המעי הגס והשכבות באגר על גבי השקף הנקי. חזור על תהליך זה עבור המעי הגס הבא.

בצעו חיתוך של המקטע, הסירו עודפי אגר, והניחו את המעי הגס המוטמע בתוך קסטה לצורך עיבוד וצביעה ב-hematin ו-eoin. איור 1 מפרט את הפרוטוקול להשראת סרטן הקשור לקוליטיס. איור 2 מציג את משקל העכבר ביחס לקו הבסיס במהלך מתן OM ו-DSS.

שימו לב כי בשבוע שלאחר כל מחזור של DSS, העכברים מאבדים 5% עד 10% ממשקל גופם. איבוד המשקל בניסוי זה מהווה מדד עקיף לחומרת הקוליטיס. איור 3 מציג מבט על גידולים במעי הגס הדיסטלי באמצעות אנדוסקופיה לעכברים ביום ה-50 של טיפול A-O-M-D-S-S.

שימו לב למסות הפוליפואידיות המרובות החוסמות את הלומן של המעי הגס הדיסטלי בלוחות B ו-C בהשוואה למעי הגס התקין. בלוח a, איור ארבע מציג מעי גס של עכבר שנפתח לאורכו, הממחיש את המראה המאקרוסקופי של הגידולים. שימו לב לעומס הגידולי הגבוה יותר במעי הגס הדיסטלי ולמרקם האופייני של המעי הגס הפרוקסימלי עם צמיחה גידולית מועטה.

איור חמש מציג גידולים המודגשים באמצעות יישום של lc וצבע כחול. שימו לב כיצד הצבע מדגיש את המרקם הנורמלי של המעי הגס וכן את הגבולות של כל גידול בנפרד. צביעה כזו יכולה לסייע במדידה מדויקת של שטחי הגידולים באמצעות סרגל או מדידה דיגיטלית.

איור שש מציג את ההתפלגות המייצגת של מספר הגידולים הממוצע לעכבר שטופל ב-OM ו-DSS. שימו לב שמרבית הגידולים ממוקמים במעי הגס הדיסטלי וגודלם פחות משני מילימטרים. איור שבע מציג חתכים אורך של מעי גס הטמיעים בפרפין בתוך קסטה ושקופית צבועה ב-h and E.

שימו לב כי שאריות של S וצבע כחול אינן מפריעות לצביעת h ו-e. גידול גדול מסומן במעגל בתמונת הפריסה. הסימונים distal, middle ו-proximal נובעים מחיתוך של המעי הגס כולו לשלישים בין העיוור (cecum) לפי התאנוס.

איור שמונה מציג היסטולוגיה מייצגת של גידול שנוצר כתוצאה ממתן OM ו-DSS במעי הגס הדיסטלי. המיקרוגרפיה המוצגת נצבעה ב-H ו-E-B-R-D-U ובבטא-קטנין, והיא מדגימה שינויים דיספלסטיים דומים לאדנוקרצינומות של מעי הגס בבני אדם. בסרטון זה, הדגמנו פרוטוקול ליצירת גידולים במעי הגס המונעים על ידי דלקת בעכברים, תוך שימוש בהזרקה בודדת של OM ולאחריה שלושה מחזורים של שבעה ימים של DSS.

במהלך תקופה של 10 שבועות, מודל זה משרה גידולים עם שינויים היסטולוגיים ומולקולריים הדומים מאוד לאלו המתרחשים בסרטן מעי גדול הקשור לקוליטיס בבני אדם, ומספק מודל בעל ערך רב למחקר של קרצינוגנזה ומניעה כימית של מחלה זו.