סינתזה שלב מוצק של פפטיד Bis פונקציונליות שימוש "בטיחות תפוס" מתודולוגיה

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לסנתז פפטיד BSP פונקציונלי באמצעות טכניקות של פאזה מוצקה. מטרה זו מושגת על ידי טעינה של חומצה אמינו BIS מוגנת על שרף של hydroxyethyl benzoic acid. לאחר מכן, חוזרים על מחזורי צימוד והגנה עמוקים כדי לחבר חומצות אמינו bis פונקציונליות, תהליך המאריך את פפטיד ה-BIS ומציג את הפונקציונליות הרצויה.

לבסוף, חומצת האמינו הביס (bis) הראשונה משונה באמצעות חומצת אמינו אלפא, כדי לנתק את פפטיד ה-BIS מהשרף על ידי יצירת DI Keto pyrazine. התוצאות שהתקבלו מעידות על סינתזה מוצלחת של פפטיד BSP פונקציונלי בטוהר גולמי טוב ובניצוליות בידוד עקבית של כ-10%, בהתבסס על ניתוח כרומטוגרפיה נוזלית עם ספקטרומטריית מסות (LC-MS). ההשלכות של טכניקה זו חולות על סינתזה מקבילית ויצירת ספריות של פפטידי ביס, כיוון שפפטידי ה-BIS מורכבים על שרף מוצק, אשר קל יותר לטיפול מאשר תגובות בתמיסה, ותוצרי לוואי מסולקים בקלות באמצעות סינון.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן רבים מהשלבים קשים ללמידה בשל ריבוי פרטים חשובים הנחוצים כדי להבטיח שכל התגובות יגיעו לסיום ככל הניתן. בסינתזה על פאזה מוצקה, אין דרך לטהר תוצרי ביניים. לכן, על מנת לקבל מוצר סופי נקי, יש להוביל כל תגובה עד למקסימום האפשרי.

אנו ממליצים להכין רשימת תיוג של הפרוצדורות הניסיוניות כדי למנוע בלבול, מכיוון שהשלבים הם חזרתיים במהותם. פרוטוקול זה מתחיל בטעינה של פפטיד ה-BSP הראשון, הגנה על פפטיד ה-BSP הראשון וסתימה (capping) סימולטנית של השרף. כדי להתחיל, טענו את פפטיד ה-BSP הראשון על ידי שקילה של 114 milligrams של שרף H-M-B-A-A לתוך כלי תגובה של שמונה מיליליטר והוסיפו מקל ערבוב מגנטי.

סגרו את חלקו העליון של הכלי בעזרת מחיצת גומי (septum) ונקו את המערכת באמצעות גז Argonne למשך חמש דקות לפחות. בינתיים, הכינו את תמיסת חומצות האמינו BIS המופעלות כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. בהמשך לסרטון זה, העבירו את התמיסה לכלי התגובה באמצעות מזרק וערבבו תחת זרימת Argonne למשך הלילה; למחרת, הסירו את המחיצה ורוקנו את תערובת התגובה.

יש לשטוף את השרף על ידי הוספת כ-2 milliliters של chloro methane לשרף. יש לערבב במשך 30 שניות עד דקה ולאחר מכן לנקז. חזור על תהליך זה ארבע פעמים עם DCM, ולאחר מכן שטוף את השרף חמש פעמים עם dimethylformamide.

לביצוע הגנה עמוקה של החומצת הנואמינו הראשונה וחסימה בו-זמנית של השרף, הוסיפו באיטיות 2 mL של תמיסה של 33% hydrogen bromide בחומצה אצטית ו-DCM לכלי התגובה. השאירו לערבב במשך 15 דקות, לאחר ניקוז ושטיפה של השרף חמש פעמים ב-DCM. חזרו על רצף ההגנה של D פעם נוספת.

בשלב הבא, יש לשטוף את השרף חמש פעמים ב-DCM ולאחר מכן חמש פעמים ב-DMF, ולנטרל את השרף על ידי שטיפה פעמיים עם תמיסה של 5% volume, volume של D-I-P-E-A ב-DMF. לאחר מכן, יש לשטוף חמש פעמים ב-DCM וחמש פעמים ב-DMF פעם נוספת. כעת ניתן לבצע צימוד של הביס-חומצה אמינו הפונקציונלית המוגנת.

ראשית, החזר את האטמוספירה האינרטית לכלי התגובה המכיל את השרף על ידי שטיפה של שלוש פעמים ב-DCM ללא מים. לאחר מכן, חבר ספטום וקו ניקוי של ארגון, ושטוף את הכלי על ידי הוספת 1 עד 2 מיליליטר של DCM ללא מים וערבוב למשך 30 שניות. לאחר מכן, רוקן את הכלי עד שבועות האוויר בקו הארגון מתחיל לעלות.

חזור על תהליך זה לפחות פעם אחת נוספת. לאחר מכן, הכן תמיסה של חומצת אמינו ביס פונקציונלית במבחנה שייבשobjetה בלהבה תחת אטמוספרת ארגון. הוסף 47 µL של DIC וערבב למשך 90 דקות.

לאחר מכן, הוסיפו 35 µL של D-I-P-E-A ב-666 µL של DMF לשרף וערבבו למשך חמש דקות נוספות. העבירו את תמיסת חומצת האמינו BIS שהופעלה מראש לכלי באמצעות מזרק וערבבו למשך הלילה עד למחרת. רוקנו את תערובת התגובה ושטפו פעמיים ב-DCM אנहाइडרלי תחת זרימה של ארגון.

שלב קריטי בפרוצדורה זו הוא צימודי החומצות האמינו הכפולות. כדי להבטיח את סגירת הטבעות של ה-di keto piperazines, אנו משתמשים בזמני תגובה ממושכים יותר עם חומרי הפעלה נוספים. כדי לקדם את סגירת ה-di keto pyrazine, יש להוסיף תמיסת HOAT ו-DIC ולערבב תחת ארגון למשך שעה אחת.

בשלב הבא, הסר את הספטום ורוקן את תערובת התגובה. שטוף את השרף חמש פעמים עם DCM וחמש פעמים עם DMF. חלק זה עוסק בהגנה עמוקה של חומצת האמינו BIS הפונקציונלית, בהגנה עמוקה של Fmoc ובאצילציה של חומצת האמינו BIS הראשונה.

כדי לבצע הגנה עמוקה של הbis amino acid הפונקציונלי המוגן, הוסיפו באיטיות שני מיליליטר של תמיסה של TFA ו-TIPS לכלי התגובה וערבבו למשך שעה אחת. לאחר ניקוז, שטפו את השרף ב-DCM למשך כ-30 שניות ולאחר מכן נקזו וחזרו על שטיפת ה-DCM חמש פעמים. לאחר מכן, חזרו על כל רצף שטיפת השרף להגנה עמוקה בהתאם לשטיפות A-D-C-M-D-M-F. נטרלו את השרף על ידי שטיפה פעמיים בתמיסה של 5% נפח של D-I-P-E-A ב-DMF.

לאחר מכן בצע שטיפה נוספת של D-C-M-D-M-F. משלב זה, ניתן להאריך את הפפטיד BIS עם חומצות אמינו bis פונקציונליות אחרות, לבצע פונקציונליזציה בחומצה קרבוקסילית של החנקן המוביל, או בשניהם. כדי להסיר את הגנת קבוצת ה-FM, הוסף תמיסה של 20% piperidine ב-DMF בנפח של שני מיליליטרים וערבב את התגובה למשך 20 דקות.

סננו ושטפו את השרף חמש פעמים ב-DMF. חזרו על תהליך זה פעם נוספת לאחר שטיפה נוספת של השרף. בודדו את הביס-חומצת האמינו הראשונה על ידי הוספת תמיסת חומצת האמינו שהוכנה לכלי התגובה וערבבו במשך שש שעות כשלב סופי.

שטוף את השרף חמש פעמים ב-DCM וחמש פעמים ב-DMF. החלק האחרון של פרוטוקול זה כולל את הסרת קבוצת ה-Bach מחומצת האמינו הקשורה לשרף ואת הניתוק מהשרף. ראשית, הוסף שני מיליליטר של תמיסת T-F-A-D-C-M ביחס של אחד לאחד לכלי התגובה וערבב במשך 30 דקות.

סנן ושטוף את השרף חמש פעמים ב-DCM. לאחר מכן, חזור על תהליך זה פעם נוספת. שטוף וסנן את השרף למשך 30 שניות, חמש פעמים עם DCM וחמש פעמים עם DMF.

בשלב הבא, יש להוסיף שני מיליליטרים של תמיסת 10% D-I-P-E-A ב-DMF אנהידרי ולערבב במשך 24 עד 48 שעות. לבסוף, יש לאסוף את תערובת התגובה לבקבוק בעל תחתית עגולה שנשקל מראש. העבירו 30 µL מתמיסה זו ל-450 µL של Tetra Hydro FU במבחנה עבור lc MS והעבירו אותה לניתוח.

יש לשטוף את הסורבנט בעזרת מנות נוספות של DMF ולאסוף אותן לבקבוק בעגול. ניתן להשתמש בשיטות הבאות כדי לנטר התמרות כימיות על גבי הסורבנט לאורך הסינתזה. כדי לזהות קבוצות הידרוקסיל חופשיות, בצע את מבחן המתיל-אדום על ידי הסרה של כמיליגרם אחד של סורבנט יבש באמצעות פיפטה חד-פעמית.

שטפו לתוך כלי תגובה של ארבעה מיליליטר. הוסיפו תמיסת methyl red שהוכנה כפי שמתואר בטקסט וערבבו במשך חמש עד 10 דקות. נקזו ושטפו את השרף חמש פעמים עם DCM; חרוזי שרף בצבע כתום או אדום מעידים על נוכחות של קבוצות hydroxyl חופשיות.

ניתן להשתמש בבדיקה זו כדי להעריך את טעינת חומצת האמינו הביס הראשונה ואת שלבי סגירת השרף (capping). כדי לזהות אמצעים משניים, בצע את בדיקת הכלורל על ידי העברה של כ-1 mg של שרף יבש למבחנה קטנה באמצעות פיפטה חד-פעמית. הוסף שלוש טיפות של תמיסת chloral בריכוז 0.8 mM ב-DMF ושל תמיסת acid aldehyde בריכוז 2% ב-DMF.

השאירו את התמיסה בטמפרטורה של החדר למשך 5 עד 10 דקות. במקרה זה, חרוזי שרף כחולים או סגולים מעידים על נוכחות של אנילינים משניים חופשיים על התרכובת הקשורה לשרף. כדי לאשש את יעילות ההפעלה, בצעו את מבחן מלכודת ההפעלה; ניתן להעריך את התרכובת הפעילה במהלך הסינתזה על ידי העברה של 5 עד 10 µL מהתמיסה הפעילה למבחנה של LC-MS המכילה 50 µL של olaine, ערבבו ידנית.

במשך מספר שניות, התמיסה אמורה להפוך לצהובה, לאחר מכן יש לדלל עם 450 µL של tetra hydro uran ולהעביר לאנליזת lc MS. ניתן להעריך את המוצר הסופי ואת התוצרים הביניים הפעילים באמצעות מערכת LCM S המצוידת בעמודה בעלת פאזה הפוכה מסוג C 18 ומערכת ממס של מים ואצטוניטריל עם 0.1% formic acid. עקבה זו של L-C-M-S-U-V מספקת דוגמה לדרגת הטהרה הגבוהה של המוצר הגולמי.

השיא העיקרי בספקטרום שנמצא בדקה 21.3 נמצא עם מסכה התואמת למסה הצפויה של המוצר. ניתן להמחיש זאת בספקטרום המסה של המוצר הגולמי, כאשר השיא חושף שיאים עיקריים התואמים למסה, בתוספת המסה של יון הנתרן, וכן את המסה פחות המסה של קבוצת ההגנה IV DDE. מוצג כאן עקב ה-LCMS UV של הספקטרא המטוהרים, החושף מוצר טהור מאוד בדקה 21.3, וספקטרום המסה המאשר את זהותו של שיא טריר מטוהר זה.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה כיצד להשתמש בטכניקות פני-מוצק (solid face) כדי לסנתז ביס-פפטידים (bis peptides) פונקציונליים לאחר פיתוחם. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביס-פפטידים לחקור יישומים באינטראקציות חלבון-חלבון ובקטליזה. ברגע שתישלטו בטכניקה זו, תוכלו להגיע לסנתזה של טרימר ביס-פפטיד פונקציונלי תוך ארבעה עד חמישה ימים, במידה ותבוצע כהלכה.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשאיר את החרוזיים טבולים בתמיסות התגובה והשטיפה במהלך הפרוצדורה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון סינתזה מקבילית או בניית ספריה, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון השפעת הסטריאוכימיה או פונקציונליות חלופית על קישור חלבונים או על פעילות קטליטית. יש לזכור כי עבודה עם ריאגנטים אורגניים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון שימוש בציוד מיגון אישי מתאים ועבודה תחת מapay (מנדף), בעת ביצוע פרוצדורה זו.