Microdialysis של אתנול במהלך אתנול נחישות ממשל עצמי ואתנול אופרנטית על ידי גז כרומטוגרפיה

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לנטר את רמות האתנול בדיאליזאט של המוח במהלך סשן של ניהול עצמי של אתנול. כדי להשוות מדד זה להתנהגויות סינכרוניות של ניהול עצמי, הדבר מבוצע תחילה על ידי השתלה כירורגית של מדריך למיקרודיאליזה, קנולה ובורג עיגון, ולאחר מכן אימון חולדות לניהול עצמי אופרנטי של אתנול. השלב השני הוא הרגלת החולדות לכישור של שלב הראש (head stage tether), כך שלא יעכב את הניהול העצמי של האתנול במהלך המיקרודיאליזה.

לאחר מכן, מתבצעת מיקרודיאליזה במהלך מפגש של מתן אתנול עצמי, במהלכו מוכן חלק מהדיאליזט לניתוח אתנול. לאחר מכן, דגימות הדיאליזט נסרקות לקביעת ריכוז האתנול באמצעות כרומטוגרפ גזים עם גילוי יינון להבה. לבסוף, התוצאות המתקבלות מראות את מהלך הזמן של הגעת האתנול לאזור המוח הרלוונטי במהלך מפגש של מתן אתנול עצמי.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון דקירה של הזנב או של הווריד הספנוס (saphenous vein), הוא שההליך גורם להפרעה מינימלית בעת איסוף הדגימות ומאפשר מדידת תרופות לאורך זמן באזור המוח הרלוונטי בעוד החיה מבצעת משימה התנהגותית. בדרך כלל, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בביצועה מכיוון שהיא דורשת מספר מיומנויות מיוחדות, שרבות מהן ניתן לרכוש רק באמצעות תרגול חוזר או ניסיון. את ההליך ידגים ג'פרי דילי (Jeffrey Dilley), עוזר מחקר לתואר ראשון במעבדה שלנו.

כל ההליכים בבעלי חיים המוצגים מאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת טקסס ועומדים בכל התקנות של המדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה. אוניברסיטת טקסס באוסטון היא מתקן המוסמך על ידי ALAC; עבור ניסויי מיקרודיאליזה התנהגותית אלו, נעשה שימוש בחולדות Long Evans שעברו השתלה כירורגית של קנולה בכיול 21 מעל אזור המוח הרלוונטי. על כל בעלי החיים לקבל שבוע אחד לפחות של טיפול והתאוששות לאחר הניתוח, ולוודא שהם בריאים לפני תחילת ההליכים הבאים.

הנח את החולדה בתא אופרנט של Med Associates, המצויד במנוף נסוג של Lichter ובשפופרת הטיה, ואמן אותה ללחוץ על המנוף כדי לקבל גישה לתמיסת סוכרוז 10%. לאחר שהחולדה אומנה להגיב עבור תמיסת הסוכרוז, התחל בלוח זמנים הדרכתי מתאים שבמהלכו מתווסף אתנול בהדרגה לתמיסה לאורך מספר מפגשי שתייה בלילה שלפני המפגש האופרנט הלפני-אחרון. לאחר הרדמת בעל החיים ובדיקת רמת הסדציה, חבר את קפיץ הקישור לבורג הקישור בראש החולדה כדי להרגילה למערך, המורכב ממנוף מאזן, זרוע, קישור מסתובב, קפיץ ומעמד טבעות.

אפשרו לחולדה לבלות את הלילה בחדר האופרנט בכלוב הבית שלה עם גישה חופשית למזון ומים, ולאחר מכן השלימו את מפגש האימון של היום הבא עם הרתמה והציוד הנלווה במקומם, יום לפני ניסוי המיקרודיאליזה. לאחר הרדמת החולדה באמצעות isof fluorine, בדקו את רמת הסדציה על ידי צביטה בבהו, והחדירו פרוב מיקרודיאליזה המוזרק בנוזל מיקרודיאליזה מלאכותי (artificial cerebral spinal fluid). קבעו את הפרוב כראוי ולאחר מכן כווננו את קצב הזרימה של הפרוב ל-0.2 µL לדקה.

הניחו את החולדה בכלוב המגורים שלה בחדר התנאיים (operant room) ללינה, כאשר כל ציוד הדיאליזה מותקן, עם גישה חופשית (ad lib) למזון ומים. ביום שלאחר השתלת הפרובה, לפחות שעתיים לפני תחילת הניסוי, הגבירו את קצב הזרימה של הפרובה לקצב העבודה שלה. באמצעות מזרק Hamilton, ודאו שקצב הזרימה של הפרובה עקבי ועומד על לפחות 90% מקצב הזרימה שהוגדר.

במידה ומעריכים מוליכים עצביים בדגימות הדיאליזה, יש לדגום במהלך כל שלבי הניסוי. התחילו באיסוף דגימות דיאליזה בזמן שהחיה נמצאת בכלוב המגורים שלה. אחסנו את הדגימות באופן מתאים לצורך ניתוח מאוחר יותר.

העבירו בזהירות את החולדה לתא האופרנט והפעילו את התוכנית האופרנטית השולטת בתא. המשיכו לדגום בעוד החולדה ממתינה להבליטה של המנוף אל תוך התא, עד לקבלת שתי דגימות לפניבליטת המנוף. התחילו לאסוף חלק מכל דגימת דיאליזט לצורך אנליזת אתנול על ידי העברת אליקוט מתאים של הדיאליזט למבחנה מזכוכית בנפח שני מיליליטר ואיטום המבחנה באמצעות ספטום אטום לאוויר; בצעו את השאיבה והאיטום של דגימות האתנול במהירות.

מכיוון שאתנול הוא חומר נדיף ונפח הדגימה קטן, הכנה לא עקבית או איטית של הדגימה תוביל לתוצאות לא מדויקות. יש לשמור את השארית לצורך אנליזה של מוליכים עצביים. תקופת השתייה של 20 דקות מתחילה לאחר שתוכנת המחשב של Med Associates דוחפת את המנוף אל תוך התא והחולדה לוחצת עליו כדי לקבל גישה לבקבוק עם תמיסת שתייה.

המשיכו לדגום לאורך כל תקופת השתייה; לאחר תקופת השתייה, תוכנת המחשב תסוג את הבקבוק מהתא. השאירו את החיה בתא למשך תקופה נוספת של 20 דקות לאחר השתייה בסיום ניסוי המיקרודיאליזה. לאחר הרדמת החולדה, הוציאו את הפרובה.

אם החיה אינה עוברת הרג הומני באופן מיידי, החזיר את הסותם כדי להבטיח את ויזואליזציית נתיב הגשושית. אסוף את המוח בתוך שלושה ימים מסיום הניסוי. נתח את הדגימות יחד עם סטנדרטים חיצוניים של אתנול באמצעות כרומטוגרף גז בעל גלאי יינון להבה (FID), דוגם אוטומטי של headspace המחומם ל-50 °C, ועמודה קפילרית עם הליום כפאזה ניידת.

עבור הקלטה וניתוח של הכרומטוגרמות, השתמש בתוכנת תחנת עבודה לכרומטוגרפיה כדי להכין את המערכת לניתוח אתנול. השתמש במקלח מים עם סירקולציה כדי לחמם את פלטת הדוגמאות האוטומטית (autosampler) ופתח את מיכלי האוויר והמימן. לאחר מכן, הפעל את תוכנית ההפעלה.

כאשר המערכת מוכנה, התחל שריפה למשך 20 דקות, שתבצע דה-קונטמינציה לסיב. הכן תמיסות סטנדרט באמצעות בקבוק מדידה נפחי של 100 milliliter כדי לדלל 238 microliters של 95%ethanol במים לנפח סופי של 100 milliliters. השתמש בדילול סדרתי ביחס של אחד לאחד ליצירת הסטנדרטים.

העבירו באמצעות פיפט את התמיסות הסטנדרטיות למבחנות זכוכית ואטמו אותן בדיוק כפי שהודע בהכנת הדגימות. הקפידו להריץ בקרת מים (water blank) יחד עם הסטנדרטים. הניחו את הסטנדרטים ואת הדגימות במגש של הדוגם האוטומטי, וחממו אותם עד שכל מנת הנוזל תתאדה.

להרצת התקנים והדגימות, צור רשימת דגימות המציינת איזו דגימה נמצאת בכל חריץ של הדוגם האוטומטי, וציין כי יש לנקב כל דגימה. לאחר מכן, נתב את קבצי הנתונים לתיקייה נבחרת, בחר את השיטה המתאימה לדגימות והתחל בהרצה. לאחר שהמערכת סיימה להריץ את הדגימות, ודא שהתוכנה ביצעה אינטגרציה נכונה של כל פיסגה.

שרטט את גובה השיא כפונקציה של כל סטנדרט חיצוני ידוע. ריכוז אתנול. השתמש בפונקציה הלינארית המתקבלת מהנקודות כדי לבצע אינטרפולציה של ריכוז האתנול בכל דגימת דיאליזאט.

איור זה מציג כרומטוגרמות לדוגמה עבור שלושה ריכוזים של תמיסות סטנדרט של אתנול ואחת עבור דגימת דיאליזאט של חולדה שנאספה בסוף סשן של administration עצמית של אתנול. שיאי האתנול צריכים להיות סימטריים יחסית, עם זמני שימור עקביים ויחס אות לרעש הגבוה מ-10. אי-עמידה בקריטריונים אלו מעידה על כך שהמערכת דורשת תחזוקה; כרומטוגרפיה איכותית וסטנדרטים תקינים יוצרים עקום סטנדרטים לינארי המשמש לחישוב ריכוז האתנול בדגימות דיאליזאט שנאספו מבעלי חיים בביצוע administration עצמית של אתנול במהלך תקופת ה-administration העצמית שלהם.

ריכוזי האתנול שהופקו מהדיאליזט אינם מתוקננים להשבה של הפרובה in vivo והם מהווים רק חלק מרכיז האתנול ברקמת המוח. אם נדרשת מיקרודיאליזה כמותית של אתנול, יש לקבוע באופן ניסיוני את שבר המיצוי של האתנול המדיף מהחלל החוץ-תאי אל תוך הפרובה. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בערך בארבע עד חמש שעות, אם היא מבוצעת כראוי.

שלב זה ישתנה בהתאם לאורך הסשן ההתנהגותי. השלמה מוצלחת של שלב המיקרודיאליזה בניסוי תלויה במידה רבה באיכות שלבי ההכנה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לוודא שהחולדות מטופלות היטב ושהן הורגלו לכל גירוי שעלול להסיח את דעתן במהלך ניסוי הדיאליזה, וזאת על מנת שהתנהגות ההגשה העצמית של בעל החיים לא תיפגע.