זיהוי נדיפים חוש ריח באמצעות קלטות כרומטוגרפיה-Multi-יחידת גז (GCMR) באונת מחושי החרקים
24 בפברואר 2013
רמזי ריח לתווך התנהגויות רבות ושונות בחרקים, ולעתים קרובות הם תערובות מורכבות מורכבות מעשרות עד מאה תרכובות נדיפות. שימוש בגז כרומטוגרפיה עם הקלטה רבה ערוצית באונת מחושי החרקים, אנו מתארים שיטה לזיהוי של תרכובות ביו.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות חומרי ריח בעלי השפעה ביולוגית בתערובות ריח מורכבות באמצעות הקלטות במוח של דבורת בומבוס. מטרה זו מושגת תחילה על ידי איסוף תערובות ריח בעלות השפעה התנהגותית, ושנית, על ידי הכנת הגז-כרומטוגרף ומערכות ההקלטה רב-العרוציות עבור הניסוי. השלב השלישי הוא הכנה ודיסקציה של מוח דבורת הבומבוס לצורך הקלטות עצביות באנטנה ובאובן האולפקטורי (antennal lobe).
לאחר מכן נערך הניסוי על ידי החדרת האלקטרודות לתוך אונה של מחוש, ומדידת תגובות למולקולות נדיפות המופעלות בנשיפה באמצעות ניתוח הפעילות העצבית בתגובה לריחות מורכבים ולמרכיביהם הבודדים. ניתן לזהות חומרי ריח פעילים ביולוגית שהופקו באמצעות כרומטוגרפיה גזית. לפיכך, היתרון המרכזי של טכניקה זו ביחס לשיטות אחרות כגון G-C-E-A-G הוא הרגישות של נוירוני המחוש והיכולת לאפיין כיצד נוירונים במוח מגיבים למולקולות נדיפות ספציפיות של פרחים.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן השלבים המשותפים של ניתוח אלקטרופיזיולוגי וכימי קשים ללמידה בשל טכניקת ההקלטה של ההכנה האלקטרופיזיולוגית והשלבים הדרושים לאיסוף חומרים נדיפים מהחלל העליון (headspace). אף שטכניקה זו יכולה לספק תובנות לגבי העיבוד הריחני של דבורי חורג, ניתן להחילה גם על מערכות אחרות, כגון גורמי מחלה כמו יתושים או פשקי נשיקה, או מזיקי גידולים כמו כנימות או עשים. עבור הליך זה, הכינו אלקטרודת ייחוס העשויה מחוט טונגסטן על מיקרו-מניפולטור בשני.
למיקרו-מניפולטור יש אלקטרודה רב-ערוצית, כגון חוט סלילי, tede, או אלקטרודת סיליקון רב-ערוצית, המחוברת למגבר קדם; ישנו כרומטוגרף גזי עם יציאה על שולחן BNC ממוגן. היציאה של הגלאי של ה-GC מחוברת למגבר ולמערכת רכישת הנתונים כך שגם האותים העצביים וגם אותי ה-GC מסונכרנים. בדוגמה זו, גז הנשיאה של ה-GC הוא helium והוא נמצא בעמודת DB five GC.
ה-GC משתמש במזרק עם פיצול (split) כאשר הטמפרטורה מוגדרת ל-200 °C, וטמפרטורת גלאי יינון השבלה (FID) מוגדרת ל-230 °C. לאחר חימום הדגימות ב-GC, השטף מהעמודה מופנה ביחס של אחד לאחד בין גלאי יינון השבלה לבין אנטנת B באמצעות מחבר זכוכית בצורת Y. בדוגמה זו, ה-GC משמש להעברת חומרים נדיפים שנאספו בספיחה דינמית מפרחי *Mimus lewisii*, פרח בר אלפיני מקורי מקליפורניה.
לחלופין, במקום שימוש ב-gc, ניתן להעביר תרכובות נדיפות בודדות או תערובות של תרכובות באמצעות פולסי אוויר. אלו מוזרקים באמצעות מזרק זכוכית נפרד המכיל פיסת נייר סינון שעליה הופקדו התרכובות. פולסי האוויר מופנים מזרם אוויר קבוע באמצעות שסתום מופעל סולנואיד הנשלט על ידי מחשב.
התחילו את ההכנות על ידי חיתוך של כמילימטר אחד מקצהו של טיפ פיפטה בנפח של 1 ml. הניחו דבורה בבסיס טיפ הפיפטה ודחפו אותה בעדינות לעבר הקצה opposite של הטיפ, עד שרק הראש נשאר חשוף. בעזרת שעווה דנטלית מומסת, צרו תבנית מסביב לראש החשוף.
יש להדביק את השמאע לעיניים המורכבות כדי לקבע את הראש באופן מלא, אך יש להימנע ממגע עם המחושים במידת הצורך. השתמשו בסיכות קטנות כדי לקבע את המחושים. לאחר מכן, בצעו חתך בצורת חלון ריבועי בקשרי הראש באמצעות להב חד, כגון מיקרו-סקלפל.
התחילו בחיתוך ישירות מאחורי המחוש ואסמוכת לאחת העיניים המורכבות. חתכו בקו ישר בין העיניים. לאחר מכן, חתכו גבית (dorsally) עד שהקפסולה של הראש מתעקלה לעבר החזה.
המשיכו בחיתוך עד לקצה הנגדי של קפסולת הראש. לבסוף, חתכו חזרה לנקודת ההתחלה כדי להשלים את הריבוע. השתמשו בפינצטה להסרת הקוטיקולה.
יש להסיר את הקוטיקולה הסמוכה למשש, אחרת היא תפריע לאלקטרודה ברגע שהמוח ייחשף. יש להשקות מיד את הרקמה במי מלח לחרקים (insect saline). ודא שונות המשש חשופות היטב.
לאחר מכן, השתמש בזהירות בפינצטה עדינה מאוד כדי להסיר את המעטפת הפרי-נוראלית (perineural sheath) שמעל לאונות האנטנה באופן מיידי. הקפד מאוד לא לדקור את מוח הדבורה עם הפינצטה. הכנת הדבורה מוכנה כעת להקלטה אלקטרופיזיולוגית.
התחילו בחיבור הדבורה המוכנה לתפסנית המקובעת לבסיס מגנטי. שמרו על הדבורה במצב של סופר-פיוזן באמצעות תמיסת סלין לחרקים המוזרמת ממאגר עם בקר זרימה. כעת, הכניסו את אלקטרודת הייחוס לרקמת המוח בצד הנגדי.
בשלב הבא, הכניסו את האלקטרודה רב-הערוצית לאונות האנטנה של הדבורה. כאשר האלקטרודות במקומן, המתינו 30 עד 60 דקות עד להתייצבות ההקלטות.
במהלך זמן זה, הכן את הספייקים (spikes) החוץ-תאיים מהנוירונים באמצעות קביעת סף (thresholding). ייתכן שיהיה צורך בקביעת סף ידנית עבור ערוצי הקלטה בודדים בשל רעש בערוצי ההקלטה. לאחר מכן, ודא שמעלות הטמפרטורה (temperature ramp) של הרצת ה-GC נכונות.
בדוגמה זו, הטמפרטורה מתחילה ב-50 °C למשך ארבע דקות ואז עולה ב-10 °C לדקה עד לטמפרטורה סופית של 220 °C, או נשמרת למשך שש דקות. כאשר צורות גלי הניטור בערוצי ההקלטה הופכות עקביות, ההקלטות העצביות נחשבות ליציבות. לאחר ההתייצבות, מלאו את המזרק בריח מהחלל שמעל הפרחים (floral headspace odor) והזריקו את הריח לפתח ההזרקה של ה-gc.
לאחר מכן, התחילו מיד להקליט מהאלקטרודות ברגע שריצת ה-GC הסתיימה. הניחו להכנה לנוח במשך חמש עד 15 דקות. לאחר מכן, מזריקו דגימה נוספת ל-GC או עוררו את ההכנה באמצעות תרכובות נדיפות בודדות או תערובות של תרכובות.
אם בכל שלב הפעילות הספונטנית פסקת פתאומית או השתנתה, יש לבדוק את טפטוף התמיסה המלוחית ולהניח לתכנית לנוח במשך 15 דקות. לאחר מכן, אם הפעילות אינה חוזרת לרמתה הקודמת, יש להשליך את התכנית. עם סיום הניסוי, קבע את המוח כאשר הגששים עדיין נמצאים ברקמה, לאחר מכן הוצא את המוח, נקה את חומר הקיבוע ובצע דהידרטציה למוח.
ניתן לזהות את מיקומי ערוצי ההקלטה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית מהניחוח הפרחוני של ה-mimus Luci. מספר התעופה total של התעופה הוא looting through. ה-GC כולל בדרך כלל בין 60 ל-70 תרכובות.
הריח של Mimus Luci מורכב בעיקר ממונוטרפנואידים, כולל beta myosin ו-alpha pinine. שאר הריח מורכב מחומרים נדיפים בעלי שש פחמנים. מספר דגימות עוברו גירוי באמצעות 3 µL של תמצית עין של Mimus Lewis.
הקלטה זו מאחת משמונה היחידות העצביות שהוקלטו על ידי האלקטרודה הרב-ערוצית מראה עד כמה נוירון ספציפי מגיב למולקולות נדיפות מסוימות. בדוגמה זו, מוצג התרכובת dine. כאן מוצגות התגובות של שמונה יחידות עצביות.
בערך מחצית מהמקבץ לא הגיבה. תוצאה זו מפתיעה בהינתן המגוון של תרכובות נדיפות שזוהו במרחב האוויר מעל הפרחים, אך היא עקבית בין דגימות שונות ומדווחה במחקרים אחרים. קצב הירי הנורמלי של היחידות המגיבות מראה כי קיימת סלקטיביות חזקה לקבוצה של חומרי ריח.
החומרים הריחניים המסומנים בחצים עוררו את התגובות החזקות ביותר. אלו הם demine ו-trans beta osain. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן הכנת החרק לניסוי ולאחר מכן ביצוע הניסוי באמצעות כרומטוגרפיה של גז עם הקלטה רב-ערוצית.
המטרה היא אם כן לזהות חומרי ריח שחשודים כי הם יעילים התנהגותית בתוך בוקה מורכב. ברגע שהטכניקה תשלט, ניתן לבצע אותה בשעתיים עד שלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי לפי פרוצדורה זו. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון בדיקה התנהגותית עם חומרי הריח שזוהו, כדי לקבוע באופן מלא את יעילותם של החומרים הנדיפים בתיווך התגובה ההתנהגותית של החרק.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בזיהוי ריחות בעלי השפעה ביולוגית בחרקים, ובפרט באמצעות הקלטות במוח של דבורי בומבוס. השיטה כוללת איסוף של ריחות רלוונטיים מבחינה התנהגותית וניתוח התגובות העצביות לתערובות מורכבות אלו.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה התנהגותית
- מחקר ריח
רקע
- חרקים משתמשים ברמזים ריחוניים עבור התנהגויות שונות.
- רמזים ריחוניים הם לרוב תערובות מורכבות של תרכובות נדיפות.
- הבנת רמזים אלו יכולה לספק תובנות לגבי התנהגות חרקים.
- כרומטוגרפיה גזית היא טכניקה מרכזית לניתוח תרכובות אלו.
מטרת המחקר
- לזיהוי חומרי ריח פעילים ביולוגית בניחוחות מורכבים.
- למדידת פעילות עצבית בתגובה למולקולות נדיפות ספציפיות של פרחים.
- לשיפור ההבנה לגבי האופן שבו חרקים מעבדים מידע ריחוני.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- איסוף של ריחות בעלי השפעה התנהגותית.
- הכנת גז כרומטוגרף ומערכות הקלטה רב-ערוציות.
- ניתוח של מוח הדבורה העומלת לצורך הקלטות עצביות.
- החדרת אלקטרודות לאונה האנטנלית למדידת תגובות.
תוצאות עיקריות
- זיהוי של ריחונות בעלי פעילות ביולוגית באמצעות כרומטוגרפיה של גזים.
- הדגמה של הרגישות של נוירונים באונה של המחוש (antennal lobe).
- אפיון של תגובות עצביות לניחוחות מורכבים.
- השוואה של טכניקה זו לשיטות אחרות, תוך הדגשת יתרונותיה.
מסקנות
- השיטה מזהה ביעילות חומרי ריח המשפיעים על התנהגות חרקים.
- הקלטות עצביות מספקות תובנות בעלות ערך לגבי עיבוד ריח.
- ניתן ליישם גישה זו במחקרים נוספים בתחום מחקר הריח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
זיהוי חומרים נדיפים בעלי פעילות ביולוגית המניעים התנהגות של חרקים הוא קריטי עבור ביוטכנולוגיה חקלאית ותוכניות לבקרת וקטורים. טכניקת ה-GCMR מאפשרת זיהוי ברגישות גבוהה של תרכובות פעילות התנהגותית על ידי קישור בין ניתוח כימי לבין תגובות עצביות במוח החרק. דבר זה תומך בתיקוף מטרות ובפיתוח בדיקות עבור אסטרטגיות לניהול מזיקים ומשיכת מאביקים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי זיהוי חומרים נדיפים המעוררים תגובות עצביות משמעותיות באונה האנטנלית.
- ערך תפעולי: מספק הפחתת סיכונים ביולוגית באמצעות תיקוף פונקציונלי של פעילות ריח במערכת רלוונטית למחלה.
- ערך חיזוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי הבחנה בין תרכובות פעילות התנהגותית לבין מרכיבים לא פעילים בתערובות מורכבות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף (אונה של מחוש בדבור בומבוס) לסריקה של ספריות חומרים נדיפים.
- תוצרים כמותיים: מספק קריאות מדידות של פעילות עצבית המאפשרות השוואה בין תרכובות ובחירת פגיעות (hits).
- שימוש חוזר בפלטפורמה: תומך במדרגיות על פני מודלים של חרקים, כולל וקטורים של מחלות ומזיקי גידולים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: רלוונטי לזיהוי של חומרי משיכה או דחייה עבור חרקים ממיתים (וקטורים) כגון יתושים ופשפשי נשיקה.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי, דרך אישור התגובה העצבית, ועד להערכה פרה-קלינית של יעילות חומרים נדיפים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבהיר כיצד חומרים נדיפים ספציפיים מעובדים במרכז הריח, ובכך מפחית עמימות בחיזוי תוצאות התנהגותיות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת (Pipeline)
שיטת ה-GCMR משתלבת ברצף הגילוי, החל מזיהוי מטרות מוקדם ועד לאופטימיזציה של תרכובות מובילות (lead optimization), במיוחד עבור תרכובות המשפיעות על התנהגות ביישומים של בריאות הציבור וחקלאות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות על ידי קישור חשיפה לחומרים נדיפים לדפוסי הפעלה עצבית באונה האנטנלית.
- סריקה: מאפשרת סטנדרטיזציה ושיחזור של הבדיקה באמצעות GC מסונכרן והקלטה עצבית רב-ערוצית.
- אנליטיקה: מספקת פלטי מיון פולסים (spike sorting) וקביעת סף המאפשרים כימות של תגובות ספציפיות ליחידה לחומרים נדיפים בודדים.
- מחקר תרגומי: מקשרת נתוני תגובה עצבית לרלוונטיות התנהגותית בהקשרים של האבקה, הרבבוריה והעברת מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר לסריקת ספריות של חומרים נדיפים במגוון מיני חרקים והקשרים אקולוגיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי זיהוי תגובות ברמת עיבוד עצבי קונברגנטי.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של הכנת המוח, פרפוזיה במי מלח וייצוב אלקטרודות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) על ידי תיעדוף חומרים נדיפים עם תגובות עצביות חזקות, ובכך מפחית השקעה בתרכובות שאינן פעילות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קידום מותאם סיכונים של חומרים נדיפים מובילים בהתבסס על יעילות עצבית ומתאם התנהגותי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיסקציה של חרקים, אלקטרופיזיולוגיה וסנכרון של כרומטוגרפיה גזית.
- תלוי במערכות אלקטרודות רב-ערוציות, קדם-מגברים ומערכות לרכישת נתונים המסוגלות ללכידה סימולטנית של אותות עצביים ושל GC.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים עבור מיקום האלקטרודות, קביעת ספי סף ועקביות בהגשת הריחות.
- התאמה בין מערכות מודל עשויה לדרוש התאמות בטכניקות לחשיפת המוח ובהרכב התמיסה המלוחית.
- מגבלות מעשיות כוללות את משך יציבות ההכנה והנטייה לאובדן פעילות ספונטנית במהלך ניסויים ממושכים.
