ויזואליזציה של תגובות מושרות רעלן של חיידקים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תא החי

מטרת הליך זה היא להדמיות של תגובות של תאי מערכת החיסון לרעלנים חיידקיים. ראשית, הרעלן מבוטא ומטוהר מתאי BL 21 gold. לאחר אישור הפעילות והריכוז של הרעלן, הוא מועבר לתאי מערכת החיסון.

ביצוע הפעולה נעשה באמצעות מיקרו-מזרק ומיקרוסקופיה של תאים חיים במהירות גבוהה. ניתוח של התמונות שהתקבלו חושף את הקינטיקה בזמן אמת של תגובות תאי מערכת החיסון לרעלן. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון מנגנון ההפעלה של האינפלאמסום.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי תגובות של תאי מערכת החיסון המתווכות על ידי רעלנים, ניתן להחיל אותה גם על גירויים אחרים, כולל גורמים כימוטקטיים. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה במהלך מחקר על האינטראקציה של חיידקים עם תאי מערכת חיסון בתרבית, כאשר נצפו אינטראקציות משתנות מאוד בין החיידקים לתאי מערכת החיסון. התחילו את טיהור ה-strep lysin O או ה-SLO עם תרבית של תאי BL 21 gold המכילים PAG three SLO.

גדלו את הפלסמיד עד ל-OD של כ-0.6. כדי להשרות את ביטוי החלבון, הוסיפו חמישה מיליליטר של 20% OSes לתרבית ונערה ב-225 RPM בטמפרטורת החדר למשך שלוש שעות. לאחר מכן, העבירו את החיידקים לבקבוק צנטריפוגה של 500 מיליליטר.

לאחר מכן, סובב את התרבית ב-12,000 ×g למשך 12 דקות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר הסבוב, שפוך את הנוזל העליון ושמור את המשקע בטמפרטורה של 80- °C למשך לילה או זמן רב יותר במידת הצורך. כדי לטהר את ה-SLO שהובע, הוסף 10 milliliters של ly wash buffer מועשר ב-Triton X 100, ליזוזים ו-phenyl methyl sulfuryl fluoride אל המשקע הקפוא, ובצע פיפוט מעלה ומטה למשך כ-15 דקות.

לביצוע השעיה (Resus), השעו את המשקע תוך שמירה על הדגימה על קרח. העבירו את המשקע המושעה למבחנה עגולה בעלת תחתית מעגולית מポリפרופילן של Oak Ridge בנפח 50 milliliter. בצעו סוניקציה לליזאט באמצעות סוניקטור עם פרובה בהספק של 40% output, חמש פעמים למשך 30 שניות בכל פעם, במרווחי זמן של 30 שניות, עם 30 שניות של קירור על קרח בין הפעולות.

לאחר מכן, סבבו את הליזאט שעבר סוניקציה ב-39,000 ×g למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4°C. לאחר הסבב, הוסיפו את הסופרנאט הבקטריאלי ל-1 mL של חרוזי ניקל NTA שטופים. דגרו את חרוזי הניקל NTA והליזאט יחד למשך 2.5 שעות בטמפרטורה של 4°C תחת ניעור עדין לאחר הדגירה.

שקעו את החרוזים על ידי סבוב ב-400 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C. שימו לב שכל השטיפות הבאות והאלוציה מבוצעות בהגדרות סנטריפוגה אלו, אלא אם צוין אחרת. לאחר הסנטריפוגה.

ערבבו 30 µL מהסופּינאט עם 10 µL של בופר דגימה SDS בריכוז פי 4 באבוב מיקרו-צנטריפוגה ושמרו על קרח לצורך אנליזת טוהר. לאחר מכן, השליכו את שאר הסופּינאט ושטפו את החרוזיים ארבע פעמים בבופר שטיפה המכיל lice, ולאחר מכן פעם אחת בבופר מלח, תוך ביצוע צנטריפוגה בין כל שטיפה. מנקודה זו ואילך, הקפידו לשמור על הדגימה על קרח בכל עת.

SLO הוא חלבון רגיש מאוד לתהליכי חמצון-חיזור והוא יאבד את פעילותו במהירות אם יחומם ל-37 °C, גם אם למשך פרק זמן קצר. כדי להפיק את חלבון ה-SLO, הוסיפו למטבעים (beads) מיליליטר אחד של בופר אלואציה וחמישה מיקרוליטרים של DTT בריכוז 1 M, והדריכו על קרח למשך 10 דקות. לאחר מכן, סובבו בצנטריפוגה ואספו את הנוזל העליון (supernatant) לשפופרת צנטריפוגה המסומנת במספר האלואציה.

חזור על תהליך זה שלוש פעמים, ולאחר מכן, כדי להסיר אנדוטוקסינים מחלבון ה-SLO, הוסף לדגימה 200 µL של agro beads מצומדים למערבב poly washed, המוספחים ב-res salt buffer, ונער בטמפרטורה של 4 °C למשך 30 דקות. לאחר מכן, סבב בצנטריפוגה ב-10,000 ×g למשך דקה אחת בטמפרטורה של 4 °C. לאחר הסבב, אסוף את supernatant לשפופרות מיקרו-צנטריפוגה חדשות ומסומנות.

שלבו 30 µL מכל אלוציה עם 10 µL של בופר דגימה SDS בריכוז פי 4. לצורך אנליזה של SDS-PAGE, שמרו את תמיסאות ה-SLO על קרח. קבעו את ריכוזי החלבון ואת הפעילות ההמוליטית; אם התוצאות מספקות, חלקו את ה-SLOE למנבובות של 5 עד 10 µL, לאחר מכן הקפיאו על קרח יבש ושמרו בטמפרטורה של 80°C-.

לאחר מכן קבע את הליסיס הספציפי. Reese. השעה את התאים לבדיקה בשני מועדים. רכז את ששת התאים למילליטר בבופר RB עם 20 micrograms per milliliter.

פרופידיום יודאיד. כאן נבדקים תאי T 27 A. יש להוסיף 100 µL של תאים לכל באער בלוח 96 באערים עם תחתית V, באמצעות מבחנות מיקרו-צנטריפוגה נפרדות.

בצעו דילול סדרתי של SLO עד לפעמיים מהריכוז הסופי בבופר rb. לאחר מכן, הוסיפו לתאים 100 µL של רעלן או 100 µL של בופר RB, והדגרימו למשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 °C. ריכוזים סופיים טיפוסיים נעים בין 2000 units/mL ל-31.25 units/mL.

העבר את התאים לניתוח בציטומטר זרימה ואסוף נתונים באמצעות פילטרים עבור fi, cethrin או pe.Kסטייה של לוג אחד מייצגת תאים בעלי חדירות זמנית, בעוד שסטייה של שלושה לוגים מעידה על תאים מתים. חשב את הליזיס הספציפי של התאים על ידי חיסור אחוז התאים המתים בקבוצת הביקורת מאלו של קבוצת הניסוי, באמצעות המשוואה המוצגת כאן; יום אחד לפני הניסויים, זרע את ה-five macrophages על זכוכית מצופה קולגן.

צלחות של 35 מילימטר בעלות תחתית שטוחה. המיקרוסקופ המשמש להחדרת הרעלן צריך להיות מצויד בבמה הפוכה, במה מחוממת, קוביית מסנני עירור ופליטה מתאימה, ובמידת האפשר בעדשת ברטנד (Bertrand lens). השלב המאתגר ביותר בפרוצדורה זו הוא הורדת המחט אל התאים באופן ששמירתה תישאר שלמה.

כדי להבטיח הצלחה, אנו משתמשים בעדשת ברטראן (Bertrand lens), המשמשת בדרך כלל ליישור, כדי להדמיות את המחט בעת העברתה דרך מישורי המוקד. המיקרוסקופ צריך להיות מחובר למיקרו-מזרק (micro injector) ולהיות נשלט על ידי מחשב עם זיכרון מספיק לאיסוף ואחסון נתונים; הפעילו את המיקרוסקופ ואת המיקרו-מזרק ואפשרו לבמה המחוממת זמן להתחמם ל-37 °C. סמנו את התאים במשך 30 דקות בעזרת צבע ב-37 °C.

בהתאם לסוג הבדיקה, ניתן לבצע את הסימון באמצעות five µL של four או 2:00 AM ב-1 mL של HBSS, או two µL של calcium am ב-1 mL של מצע מלא; כאן נעשה שימוש ב-four או two. יש להסיר את מצע התאים ולשטוף את התאים פעם אחת עם PBS. יש לשאוב את ה-PBS ולהחליפו ב-1 mL של RPMI המועשר ב-2 mM של calcium chloride.

הנח את הצלחת על המיקרוסקופ, התאם את המיקוד של התאים באמצעות שדה בהיר (brightfield), ולאחר מכן כוון את המיקוד מעט מעל התאים. כעת, ערבב מיקרוליטר אחד של רעלן SLO, ארבעה מיקרוליטרים של DEXTRA 5 55 בריכוז 10 mg/mL ושישה מיקרוליטרים של מים. לאחר מכן, סבב במcentroid במהירות של 20,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C.

משתמשים בדקסטראן כדי לוודא שקצה הפמטו (femto tip) אינו סתום. השתמשו במיקרו-טוען (micro loader) כדי להטעין שני מיקרוליטרים של רעלן מדולל לתוך קצה הפמטו מהחלק האחורי. הרכיבו את קצה הפמטו על המיקרו-מזרק (micro injector).

לאחר מכן, כווננו את זווית המזרק כך שהקצה ימוקם מעל מרכז התאים, עם מרווח לתנועה לכל הכיוונים. ננקה את ההגדרות הקודמות של גבול ה-Z, המגביל את העומק אליו יכול לרדת קצה המיקרו-מזרק. נגדיר את המיקרו-מזרק להזרקה למשך 0.5 seconds בלחץ של 120 PSI עם לחץ נגדי של 20 PSI. לאחר מכן, נוריד את הקצה עד שיחדור אל תוך המדיום.

השתמשו בעדשת ברטראנד (Bertrand lens). מרכזו את קצה המחט ועקבו אחריו בעת הורדתו קרוב יותר לתאים. ברגע שהמחט יוצאת מהמיקוד, חזרו לאופטיקה רגילה.

צללית המחט צריכה להיות גלויה בשדה הראייה. התמקדו מעל התאים והורידו את המחט עד שתהיה במיקוד. לאחר מכן, התמקדו בתאים וקרבו בזהירות את המחט אל תא מסוים.

לאחר קביעת גבול ה-Z להזרקה, התחילו בצילום והזריקו את הרעלן. לאחר מכן הרימו את המחט ועברו לאזור תאים חדש. הזריקו רעלן נוסף והמשיכו בצילום לאחר ההזרקה.

העבירו את המחט למצב בית כדי למנוע דליפה לא רצויה של רעלים מהמחט באמצעות השיטה המתוארת בסרטון זה, 10⁷ עד 10⁸ יחידות למיליליטר. SLO מופק בדרך כלל בריכוז חלבון של 4 mg/mL. ג'ל SDS-PAGE זה מציג דגימות חיידקים לפני ואחרי השראה של רעלן, לאחר טיהור, וכל אחת משלוש האלוציות. צביעה ב-Coomassie blue מעידה על כך שה-SLO שהושרה טוהרה בהצלחה.

הפס SLO הוא בעל משקל של 69 kilodaltons, ומשמש לקביעת כמות הרעלן הנדרשת לליזיס של תאי T 27 A או D two. התאים נחשפו לריכוזים שונים של SLO למשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 °C בנוכחות propidium iodide, ונבחנו באמצעות flow cytometry. ליזיס ספציפי נקבע כפי שמוצג כאן.

250 יחידות למילליליטר. SLO גורם לליזה של 50% הן בתאי T 27 A והן בתאי D two. מינון רעלים תת-ליטי של 10% ליזה יהיה 62.5 יחידות למילליליטר.

ערכים אלו חשובים לצורך כיול פעילות הרעל להערכת מוות תאי בעקבות חשיפה לרעל. פיברובלסטים עוריים אנושיים דגרו עם calcium ו-atherium homodimer באמצעות ערכת live dead מבית life technologies. לאחר חשיפה מקומית לרעל הבקטריאלי, anthro lysin O. בתמונה זו, calcium מוצג בירוק ו-atherium bromide באזורים אדומים קרובים למיקרוביום, המראים מוות תאי המאופיין באובדן calcium ובספיגת athe homodimer, בעוד שבאזורים רחוקים יותר מהקצה לא ייראה נזק.

הגשה זעירה של הרעלן מאפשרת גם לבחון אירועים בזמן אמת, כגון זרימת סידן. תאי dcs אנושיים אלה, שהועמסו ב-4:02 AM, נחשפו ל-SLO בקצב זרימה קבוע עם דימוי חי סימולטני המראה מעבר מירוק לכחול. צבע פסאודו מעיד על עלייה ברמות הסידן הציטוזולי.

SLO גורם לעלייה מהירה בסידן הציטוזולי, אשר מופצת ברחבי אזור הצלחת בשל ההגשה המקומית. עם זאת, רק תאים הקרובים לקצה המיקרו-מזרק נחשפים לרעלן ומגיבים אליו. הדבר מדגים הן תגובה תאית לרעלן והן את השטח המוגבל מרחבית של הגשת הרעלן כדי להבחין בין אירועים בממד ה-zdi.

שיטת ה-Micro delivery שולבה עם מיקרוסקופיה קונפוקלית בתלת-ממד במהירות גבוהה. סט תמונות זה מציג תאי דנדריטיים לאחר הזרקת רעלן. התאים עברו דגירה מוקדמת עם anti CD 11 C המצומד ל-PC המוצג בירוק לסמן את ממברנת הפלזמה.

כפי שניתן לראות כאן, מיקרו-וסיקולות משתחררות בעקבות הובלת הרעלן. כחלק מתהליך התיקון התאי, מולקולות רעלן מרכזות בבליטות (blebs), אשר נשפכות כדי לסלק את הרעלן. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע את המיקרוסקופיה תוך 45 דקות.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על הרעל בקירור לפני הערבוב עם התאים ולבדוק את הפעילות ההמוליטית. מצוין. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה כיצד למדוד קינטיקה בזמן אמת של תגובות תאי חיסון לרעלים בקטריאליים באמצעות מיקרוסקופיה של תאים חיים.