שימוש בLysoTracker לזהות מות תאים מתוכנים בעוברים ומיון תאי גזע עובריים

מטרתו של ההליך הבא היא להדגים כיצד לסמן את הליזוזומים של שני סוגי דגימות, עוברים של עכברים ותאי גזע מובחנים, באמצעות צבע lyo tracker כדי לזהות תבניות של מוות תאי. להכנת דגימות עוברים, העוברים מבודלים תחילה בניתוח ומונחים בצלחת כדי להכין תאים מובחנים. תאי גזע עובריים משמשים ליצירת גופי עובר.

גופי עוברים אלו גודלים בתרבית סספנסיות ולאחר מכן גודלים כשכבה אחת (monolayer) על גבי למסלית תא (chamber slide). את העוברים בשכבה אחת ניתן לדגור עם LysoTracker Red, ולאחר מכן לשטוף ולקבע; ניתן לצלם את הדגימות כדי לבחון ולכמת את תוצאות הצביעה המראות את ה-LysoTracker. הצביעה היא הליך פשוט שניתן להשתמש בו כדי לבחון מוות תאי תכנוני (programmed cell death) בעוברים ובתאי תרבית.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון tunnel analysis, הוא שבעקבות היותו של צבע ה-OT tracker מולקולה קטנה, ניתן לבצע בדיקה של רקמה עבה במהירות ובקלות. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי דפוסי מוות תאי מתוכנן בעוברי עכבר ובתרביות מובחנות, ניתן להחיל אותה גם על סוגי רקמות אחרים, כגון עוברי תרנגולת ותאי גזע בוגרים בתהליך בידול. הצמידו נקבות עכבר צעירות לזכר פריון, ובבקרים העוקבים בדקו אם קיים פקק נבכי, המעיד על כך שהזיווג התרחש.

שעת צהריים ביום שבו מופיע הפקק הנרתיקי נחשבת למעשה ל-0.5 ימים. לאחר הזיווג, ביום העוברי הרלוונטי, יש להקריב את הנקבה בהתאם לפרוטוקולים המאושרים ולהעביר את הרחם לצלוחית פטרי של 10 סנטימטרים המכילה Hank's BSS, ולשטוף שאריות דם. הפרד את העוברים והוצא אותם מהרחם.

הסיר את קרומי העובריים העודפים ובצע שטיפה אחת לפחות עם Hank's BSS כדי להסיר רקמות זרות ודם. שמור את העובריים המנותחים על קרח בזמן הניקוי. את השאר.

הכינו חמישה מיליליטר של תמיסת צביעה לעוברי Liso tracker. נפח זה מספיק לאיסוף של עובריים אחד או שניים. ערבבו בעדינות את התמיסה כדי לפזר את הצבע באופן אחיד, לאחר מכן העבירו את העוברים לתמיסה והדגירו אותם בטמפרטורה של 37 °C למשך 45 דקות.

לאחר הדגירה, שטפו בעדינות את העוברים ב-Hank's BSS ארבע פעמים, למשך חמש דקות בכל שטיפה. חשוב לבצע את השטיפות בעדינות כדי לא לפגוע ברקמה. הסירו את הנוזל באיטיות, תוך תשומת לב רבה למיקומם של העוברים העדינים, והקפידו תמיד להשאיר חלק מהנוזל המכסה אותם.

לאחר מכן, קבעו את העוברים ב-4%para formaldehyde למשך לילה שלם ביום למחרת. שטפו את העוברים פעם אחת ב-Hank's BSS למשך 10 דקות כדי להסיר את חומר הקיבוע. כעת, בצעו דהידרטציה לרקמות באמצעות סדרת מנתנול כדי למנוע צביעת רקע.

שלב זה משפר את יחס האות לרעש במהלך הדמיה לפני האחסון. במידת הצורך, אסוף דגימת רקמה מכל עובר לצורך אנליזה גנטית. מאוחר יותר, בצע רהידרציה לדגימת הרקמה לפני הטיפוס הגנטי (genotyping).

הפרידו את העוברים למבחנות בודדות עם תוויות התואמות לדגימת הרקמה. כעת ניתן לאחסן את העוברים המבודדים ללא הגבלה במתנול בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. הגנו מאור.

התחילו בהכנת גופי עוברים בשיטת טיפה תלויה. בצפיפות התחלתית של 500 תאים לטיפה של 20 microliter לאחר שלושה ימים, העבירו את גופי העוברים לתרביות השעיה בצלחות פטרי לא-דבקות של 10 centimeter. תרבתו אותם למשך חמישה ימים, והחליפו את המצע כל יומיים לאחר חמישה ימים.

העבירו את גופי העוברים למטריצות של שמונה תאים שעברו ג'לטיניזציה, והניחו גוף של עובר אחד או שניים בכל תא. תרבתו את גופי העוברים למשך 10 ימים נוספים. לאחר 10 ימים, החליפו את המצע מדי יומיים על ידי שאיבה עדינה של המצע הקיים והוספה של 300 microliters של תמיסת צביעת תאים Lyo tracker לכל תא.

הקפידו לשאוב את המצע באופן ידני על ידי הנחת קצה הפפטה בפינת התא. בדרך זו, לא תסירו בטעות את גופי ה-C. elegans שעדיין נצמדים למשטח הזכוכית. בעת הוספת המצע מחדש, הנח את קצה הפפטה בפינת התא והוסיפו את המצע באיטיות רבה.

דגרו את התאים בתאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות. לאחר מכן, שטפו אותם פעמיים עם DPBS למשך חמש דקות לכל שטיפה. כעת, קבעו את התאים ב-4% paraldehyde למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הסר את מקבע הרקמות באמצעות DPBS בשתי שטיפות של חמש דקות כל אחת. כדי להכין את העוברים להרכבה (mounting), הנח אותם על זכוכית עם שקע עמוק או בתוך מגן של פטריה קטנה. הכן את דגימות התאים למיקרוסקופיה על ידי שאיבת ה-DPBS.

הסר את התא מהזכוכית והנח לו להתייבש באוויר במשך כחמש דקות. כסה בנייר אלומיניום כדי להגן על הפלואורסצנציה. לאחר מכן, הוסף מדיום הרכבה מימי כגון vector shield עם dappy והנח זכוכית כיסוי מעל.

כעת הזריקה הוכנה והיא מוכנה לדימות. הדמיאו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי או מיקרוסקופ אור פשוט המצויד במסנן Rod, Domine או Texas red. הצביעה היא בדרך כלל בהירה מאוד, ולכן חשיפות ארוכות אינן נדרשות בדרך כלל במצב ידני.

צלמו תמונות דיגיטליות של כל הדגימות תחת אותם תנאי חשיפה. כדי לכמת את התמונות, פתחו אותן בתוכנת Adobe Photoshop או בתוכנה דומה לעיבוד תמונות. כדי לקבוע את כמות הצביעה של lyo tracker, בחרו בערוץ האדום.

שימו לב למספר הפיקסלים של התמונה כולה כפי שמוצג על ידי פונקציית ההיסטוגרמה. לאחר מכן, בצעו סף (threshold) לתמונה כך שהצביעה האדומה תיוצג כעת על ידי פיקסלים לבנים. פעולה זו ממירה את התמונה לשחור ולבן.

בחרו רמת סף והשתמשו ברמה זו עבור כל התמונות בסט. בחרו את הפיקסלים הלבנים באמצעות כלי טווח הצבעים (color range) והשתמשו בפונקציית ההיסטוגרמה כדי לקבל את סך מספר הפיקסלים הלבנים. השתמשו בערוץ הכחול כדי לספור את מספר הגרעינים בשדה.

ייתכן שיהיה שימושי לשמור תיעוד של הספירה על ידי הוספת הערות לתמונה, רישום הערכים ושימוש בהם לחישוב רמת הצביעה הממוצעת לתא. חזור על ניתוח זה עם אותה הגדרת סף עבור כל שאר התמונות. לצורך דגימה, נעשה שימוש ב-LysoTracker כדי לצבוע עוברים עם מוטציה ב-sonic hedgehog.

מכיוון ש-ly O tracker הוא מולקולה קטנה בעלת יכולת דיפוזיה גבוהה, אזורים עמוקים בתוך העובריים של עובר שלם שנצבעו ביום ה-10.5 לאחר ההפריה, הראו עלייה משמעותית במוות תאי מתוכנן (PCD) בעוברים עם מוטציה של מחסור ב-sonic hedgehog, במיוחד באזורי הגפיים והסומייטים. ניצני גפיים צולמו כדגימות שלמות בהגדלה גבוהה יותר כדי להעריך את התבנית הכללית. חלקים שבוצעה להם דיסקציה נחתכו גם באמצעות מיקרוטום רוטט.

ראש החץ מצביע על עלייה בצביעה ב-TUNEL בקצה הדיסטלי של עוברים חסרי sonic hedgehog בחתכים שהתקבלו באמצעות קריוסטט. צביעת TUNEL בוצעה בשילוב עם OT Tracker בחתכים אלו; אף שאין מתאם חד-ערכי קשיח בין צביעת lyo tracker לצביעת TUNEL, האזורים הכלליים של PCD חופפים במידה ניכרת תחת הגדלה גבוהה יותר. ניתן לראות תאים שנצבעו חיובית בבדיקת TUNEL אך לא ב-otra die, תאים שנצבעו רק ב-lyra die, ותאים שבהם הצביעות חופפות. לאחר 10 ימים של תרבית גוף עוברית, התבדילו התאים למגוון סוגי תאים, כולל נוירונים, תאי שריר וקרדיומיוציטים.

בתרבית רגילה של תאי ES מובחנים, קיימים מספר תאים שעברו PCD, כפי שזוהו באמצעות בדיקות lyo tracker ו-tunnel. לאחר מכן, התאים טופלו במימן פראוקסיד כדי להשרות מוות תאי כתוצאה מעקה חמצוני. מינון נמוך של מימן פראוקסיד הגביר הן את צביעת ה-lyo tracker והן את צביעת ה-tunnel בהשוואה לקבוצה שלא טופלה.

בדומה לתוצאות בעובר, שני הצביעות סימנו תאים משותפים ותאים ייחודיים. מינון גבוה של מימן פחמונית (hydrogen peroxide) הוביל להתכווצות תאים ולשכיחות רחבה יותר של חיוביות ל-OT tracker ו-tunnel. לצורך השוואה, נעשה שימוש בהרעבת סרום כדי להשרות אוטופגיה לאחר שעה אחת של הרעבת סרום.

צביעת ה-OT tracker עלתה. עם זאת, החיוביות בבדיקת tunnel נותרה ברמות נורמליות. לכן, בעוד ש-reer היא פשוטה ומועילה, חשוב לבצע מעקב באמצעות בדיקות נוספות כדי לקבוע אם הצביעה מייצגת אפופטוזיס או אוטופגיה לאחר כימות הדגימות.

באמצעות שיטת הפוטושופ הפשוטה שהודגמה קודם לכן, התוצאות אישרו כי ריכוזים עולים של מימן פוקסיד הובילו לרמה גבוהה יותר של צביעת lys tracker. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע הליך צביעה זה בפחות משעתיים אם הוא מבוצע כראוי בהתאם לפרוטוקול זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון צביעה אימונוהיסטוכימית של NX-5 או LC3, כדי לאשר את סוג מוות התא. זכרו כי נכון לעכשיו Trecker green פועל רק על תאים חיים, ולכן Reca red היא האפשרות הטובה ביותר עבור דגימות הדורשות קיבוע.