איטרטיבי אופטימיזציה של דופלקסים DNA להתגבשות של מכלולי SeqA-DNA

ניסוי זה מפרט כיצד להפיק גבישים באיכות דיפרקציה של חלבון הקשור ל-DNA המכיל רצף GATC חצי-מתילתי (hemi methylated) בסידור טנדמי. חזור על הפעולה כדי לעודד אריזה גבישית של קומפלקס החלבון-DNA. התחל בתכנון רציונלי של אורך ה-DNA, המרווחים בין רצפי ה-GATC וקצות ה-DNA, המשך בשימוש באוליגנוקלאוטידים משלימים בעלי גדיל בודד כדי לטהר את ה-DNA, ולאחר מכן בצע עיגון (annealing) ליצירת דופלקס ה-DNA החצי-מתילתי, ולבסוף ערבב את seq A המטוהר כדי ליצור את הקומפלקס.

בשלב הבא, מצאו תנאים אופטימליים להבאת גבישים של קומפלקס החלבון-DNA באיכות דיפרקציה, באמצעות ניסויי התגבשות עם מסכי מטריצה דלילה (sparse matrix screens) מסחריים. תוצאות מוצגות. שתפו את ההשפעה של שינוי באורך ה-DNA, במרווח ה-GATC ובקצוות על איכות הדיפרקציה של גבישי ה-CQ A DNA.

מטרת עבודה זו היא להשיג גבישים באיכות דיפרקציה של CK הקשור ל-DNA, אך היא יכולה לסייע גם בהבנת המשתנים הכלליים שיש לשקול בעת תכנון דופלקסים של DNA לצורך גבישה של קומפלקסים אחרים של חלבון-DNA. הדגמה של הליך זה תשמש את Chang, A, עמית דוקטורט מהמעבדה שלי. מחקר זה משתמש בגרסה של חלבוני בקרה של רפליקציית DNA. Seek a שיוצר דימרים יציבים ובעל אזור קישור (linker) מקוצר בין דומיין ה-ization לדומיין הקשירה ל-DNA.

גרסה זו מגבילה את קישור ה-DNA לחזרות GATC טנדמיות המופרדות אך ורק על ידי סיבוב אחד של ה-DNA. ראשית, בצע טרנספורמציה לתאים מסוג BBL 20 1D three עם הפלסמיד המקודד ל-DEMETRIC seq A תחת שליטתו של פרומוטור T7. פרוס את תגובת הטרנספורמציה על צלחות אגר LB המכילות 100 µg/mL ampicillin והצב אותן באינקובטור חיידקי למשך הלילה. בחר מושבות מעורבבות והתחל תרבית קטנה למשך הלילה.

בבוקר למחרת, יש להוסיף לתרבית של ליטר אחד 10 milliliters מהאינוקולום של הלילה הקודם. כאשר התרבית נמצאת בשלב הלוגי (log phase), יש להוסיף two milliliters של 0.5 molar IPTG כדי להשרות את ייצור החלבון. יש להמשיך את הדגירה למשך שלוש שעות במנער אורביטלי בטמפרטורה של 37 °C.

לאחר מכן, קצרו את התאים על ידי סנטריפוגציה ב-3,300 G למשך 10 דקות. השביה את משקע התאים בבופר טיהור A באמצעות סוניקציה, והצלילו את הליזט על ידי סנטריפוגציה ב-39,000 times G למשך 40 דקות. כעת, העמיסו את הסופרנאטנט על עמודת הפרין שהושרה עם בופר טיהור.

כדי להבדיל (elute) את חלבון ה-CK. השתמש במדרג ליניארי עד ל-1 molar sodium chloride. חלבון ה-CK נבדיל בריכוז של כ-0.7 molar sodium chloride. אסוף את השברים המכילים את ה-CK ומדלל אותם כדי להוריד את עוצמת היונים של הדגימה.

לאחר מכן, טען את הדגימה לעמודת כרומטוגרפיית חילוף קטיונים המאוזנת עם באפר טיהור. החל גרדיאנט מלח ליניארי כדי לבודד חלבון CK טהור בריכוז של כ-0.4 מולארי של sodium chloride. איגד את הפראקציות המכילות CK.

רכזו לריכוז של 3 mg/mL ואספקו לאחסון. תכנון של בופר עבור אוליגו-נוקלאוטידים משלימים, לא מתילated ומתילated. הכינו דגימות של 1 µmol מכל DNA גדיל יחיד ליאפיליז ב-800 µL של מים מזוקקים פעמיים שעברו אוטוקלאב, ערבלו בוורטקס והמתינו 15 דקות, כעת ו-800 µL.

הוסיפו תמיסת טעינה (loading buffer) בריכוז 2X לכל דגימה. עבור אוליגו-נוקלאוטידים באורך של 20 עד 30 נוקלאוטידים, הכינו ג'ל דנטורציה גדול בריכוז 10%. לאחר הפולימריזציה, הסירו את המסרק ושטפו את הבארות ביסודיות. הרכיבו את הג'ל ומלאו את מאגרי החלק העליון והתחתון בתמיסת TBE running buffer בריכוז 1X.

בצע הרצה מקדימה של הג'ל ב-750 volts כדי לחמם את הג'ל ל-55 degrees Celsius. לאחר מכן עצור את ההרצה ושטוף היטב את הבארים עם running buffer. כעת חמם את האוליגונוקלאוטידים ל-90 degrees Celsius למשך שתי דקות.

ערבבו במערבל Vortex וסובבו (spin). העבירו את הדגימות מיד להטענה על הג'ל. הריצו את הג'ל במתח של כ-700 volts עד להגירת האוליגוניוקלאוטיד.

במרכז ג'ל poly acrylamide בריכוז 10%, צבעי phenol blue ו-xylene syl ff נודדים יחד עם אוליגונוקלאוטידים באורך של כ-20 בסיסים וכ-60 בסיסים, בהתאמה. פרקו את הג'ל מהמכשיר והסירו את המקריבים (spacers) על משטח שטוח. הסירו פלטה אחת מזכוכית וכסו את הג'ל בניילון נצמד.

לאחר מכן הפוך את הג'ל, הסר את לוחית הזכוכית השנייה וכסה את הג'ל בניילון נצמד. בשלב הבא, סמן את הפסים באמצעות אור UV ולוח פלורסצנטי מאחורי הג'ל. כדי לראות את צל ה-DNA, השתמש בלהב תער כדי לחתוך את הפס ולהוציאו בחתיכות קטנות.

העבירו כל דגימה למבחנה סטרילית של 15 milliliter. הוסיפו תשעה milliliters של תמיסת elution ודללו למשך לילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius תוך써 ערבוב. העבירו בזהירות את התמיסה למבחנת צנטריפוגה בעירה (autoclave) באמצעות טיפ של פפית טעינת ג'ל.

כדי למנוע העברה של חלקי אקרילאמיד, הוסיפו מיליליטר אחד של נתרן אצטט בריכוז 3 מילי-מול ב-pH 7 פלוס 25 מיליליטר אתנול 100% מקורר, והדגירו בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות לפחות. סבב את ה-DNA המשקע בצנטריפוגה. לאחר מכן, ייבשו את המשקעים ב-SpeedVac בחום בינוני, השביו כל משקע ב-400 מיקרוליטר של מים מזוקקים פעמיים שעברו אוטוקלאב, והעבירו למבחנה נקייה.

הוסיפו 40 µL של נתרקה אצטט בריכוז 3 M ב-pH 7 ו-1 mL של 100% ethanol, ערבבו ב-vortex והדגירו למשך 30 דקות ב-20- °C. לאחר צנטריפוגציה למשך 15 דקות ב-18,000 ×g, שטפו את כדורית ה-DNA ב-100 µL של 70% cold ethanol כדי להסיר שאריות מלח. סובבו בצנטריפוגה למשך שש דקות ב-18,000 ×g, לאחר מכן השליכו את ה-ethanol ויבשו את הכדורית במכשיר SpeedVac.

כעת השעיו כל משקע ב-100 µL של מים מזוקקים פעמיים שעברו אוטוקלאב. קבעו את ריכוז האוליגו-נוקלאוטידים באמצעות ספקטרומטריה. כדי להכין את דופלקסי ה-DNA המה-מתילים, ערבבו תחילה ריכוזים מולריים שווים של הגדילים הבודדים המשלימים.

לאחר מכן, חממו את התערובות ל-95 °C באמבט מים למשך חמש דקות כדי לבצע דנטורציה (anil) לגדילים. הניחו לדגימות להתקרר לאט לטמפרטורת החדר בתוך אמבט המים. ערבבו נפחים שווים של 81 µM חלבון CQ מנוקה ו-81 µM DNA המיתילי חלקית.

לאחר מכן דגרו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. שמרו בטמפרטורה של 4 °C עד לשימוש; סננו תנאים להתגבשות באמצעות מסכי sparse matrix מסחריים. ברגע שזוהו קשרי התגבשות ראשוניים, בצעו אופטימיזציה לתנאים כדי לגדל גבישים באיכות דיפרקציה. בצעו קריו-הגנה לגבישי ה-CK DNA שהתקבלו.

הגדילו את כמות ה-PEG 400 בתמיסת ההגבשה לריכוז סופי של 25% או הוסיפו 20% גליצרול לתמיסת ההגבשה. דלגו גבישים בודדים באמצעות לולאת ניילון. הקפיאו את הדגימות בחנקן נוזלי.

כעת יש לבחון את גבול העקיפה של כל גביש ב-100 k. כדי להשיג את מבנה הגביש של המוטנט המקוצר של CK הקשור ל-DNA המהמתיל חלקי, אנו מבצעים אופטימיזציה רצופה של שלושה פרמטרים ב-DNA: המרווח בין רצפי GATC המהמתיל חלקי, אורך הדופלקס והיעדר או נוכחות של בליטות ב-five prime. מחקר זה משתמש בגרסת DME של seek a עם מוטציה נקודית בדומיין הטרמינלי הקצבי המונעת ליגציה נוספת, ובלינקר מקוצר המגביל את קישור ה-DNA למבנה טנדם.

בבדיקות הזזה של ניידות DNA חשמלית (electromobility shift assays), חזרות GATC המופרדות בדיוק על ידי סיבוב אחד של הסליל מעידות כי חלבון ה-CK המודגש נקשר באופן מועדף לחזרות GATC המופרדות על ידי 9 עד 10 זוגות בסיסים. לפיכך, סריקות ראשוניות משתמשות בדופלקסים באורך של 23 עד 24 זוגות בסיסים, המכילים שתי חזרות GATC הממתילתן חלקית (hemimethylated) ומופרדות על ידי 9 או 10 זוגות בסיסים.

שלושה דופלקסים הניבו גבישים בעלי צורה טובה. למרות ששום גביש לא הראה עקיפה ברזולוציה גבוהה, הנתונים הצביעו על כך שהפרדה של תשעה זוגות בסיסים מסוג A-G-A-T-C הייתה מועדפת לקריסטליזציה; באופן בלתי צפוי, הגברת האינטראקציות של שלד החריץ באמצעות הכללת דינוקלאוטיד CG בין שני אתרי ה-GATC לא שינתה את גבול העקיפה של הגבישים.

לעומת זאת, אופטימיזציה של אורך הבליטות (overhangs) שינתה באופן דרמטי את המגעים המולקולריים ואת מורפולוגיית הגביש. מבנה הגביש של חלבון CK זה הקשור לדוּפלקס DNA ממותיל חלקית אישר כי הפנים החופשייה של דוּפלקס ה-DNA אינה משתתפת במגעים גבישיים למרות הגודל היחסי של החלבון וה-DNA; מרבית האינטראקציות בין בני זוג סימטריים מתווכות על ידי אינטראקציות חלבון-חלבון וחלבון-DNA. מעניין שבמקרה מסוים זה, ההשפעה המיטיבה של בליטת דינוקלאוטיד בקצה 5' אינה נובעת מיצירת DNA פסאודו-רציף.

במקום זאת, הקצה ה-five prime של הגדיל הממתיל בולט הרחק מצירים של ה-DNA ומקיים אינטראקציה עם מולקולת ה-CK הפרוקסימלית של הקומפלקס, מה שמסביר מדוע שני נוקלאוטידים היו נחוצים באופן מוחלט כדי לשנות את האריזה הגבישית. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה של אופן טיהור חלבונים ותכנון דופלקסי DNA עבור גביש של קומפלקס חלבון-DNA. חשוב לזכור כי למרות שפרוטוקול זה תוכנן לגביש של קומפלקס CK DNA, האופטימיזציה הרציונלית של אורך ה-DNA, הרצף והקצוות מספקת מסגרת כללית לתכנון דופלקסי DNA עבור גביש של קומפלקסים אחרים של חלבון-DNA.