וירוסי צמח באמצעות העברת Whiteflies
8 בנובמבר 2013
שיפור ההבנה שלנו ואת היכולת שלנו לנהל רבים של הווירוסים המועברים בצמחי חרקים מחייב שימוש בווקטור. שידור חרקים של וירוסי צמחים הוא אינטראקציה tritrophic, ובתור שכזה דורש מניפולציה של חרקים, וירוסים, וצמחים. וקטורים חייבים להיות שגדלו במספרים גדולים ומניפולציות באופן שעל מנת להבטיח שיעור גבוה של העברת צמחים לבדיקה. את היסודות של גידול וטיפול בכנימות, Bemisa tabaci ( Hemiptera: Aleyrodidae), וקטור של וירוסי צמחים השייכים לכמה סוגי וירוס צמח מתעוררים, המייצגים את מספר גדול של וירוסים משמעותיים מבחינה כלכלית הוא מוצג.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להעביר וירוסים של צמחים באמצעות כיניים לבנים. מטרה זו מושגת על ידי הקמה ותחזוקה של מושבה של כיניים לבנים המספקת פרטים בוגרים שזה עתה בקעו על בסיס שבועי, אשר אינם נגועים בווקטורים פוטנציאליים אחרים ובפתוגנים. המושבות מתוחזקות על ידי הוספה קבועה של כיניים לבנים לצמחים צעירים נקיים מחרקים, מהם מופקים בוגרים חדשים.
לאחר 17 עד 20 ימים בכל שבוע, ניתן להעביר את הבוגרים שזה עתה בקעו לצמחי ניסוי כדי לרכוש או להעביר את הנגיף. בדרך כלל מושגים נצאיות של כמעט 100%, ושיעורי ההעברה יתחילו בדרך כלל נמוכים ויעלו עם אופטימיזציה שיטתית. ההיבט המאתגר ביותר בשימוש בקיניי לבנים להחדרת נגיפים הוא גידול הקינייים הלבנים באופן שבו פתוגנים וחרקים לא רצויים נמנעים.
פתוגנים, ובמיוחד פטריות ריקבון שורשים ומחלות נשירה של עלים, יפחיתו את איכותן של הצמחים המאכלסים את הנגיף. חרקים לא רצויים, כגון כנימות, עלולים לדכא את רביית הקידח הלבן וכן לפגוע באיכות הצמח המאכסן את הנגיף. את הפרוצדורות תדגים הית'ר קאפא ביאנקו, טכנאית מהמעבדה שלי.
יש לתחזק מושבות של זבובים לבנים בחדר גידול נקי ומבוקר. בקרה על הלחות היחסית, הטמפרטורה, מחזור התאורה ועוצמת האור חיונית עבור מושבה המתפתחת מביצה לבוגר תוך 18 ימים; השתמשו בהגדרות הבאות. יש לכוון את הטמפרטורה לטווח שבין 26 ל-30 °C, והלחות היחסית צריכה להיות באופן אידיאלי בין 30% ל-50%. אם הלחות היחסית תעלה מעל 70%, סביר שפתוגנים פטרייתיים של חרקים וצמחים יהפכו לבעיה.
תנאי התאורה האידיאליים הם מחזור של 14 שעות. עוצמת התאורה צריכה להיות גבוהה למדי, ונורות פלורסצנט VHO יכולות לספק 800 עד 1000 foot candles מעל חופת הצמח. יש להפחית את כמויות הדשן ואת השקיית הצמחים כדי למנוע התפתחות פטריות וכן הצטברות של מלחים. כלובים עבור whitely חייבים לאפשר אוורור, גישה נוחה ומספיק מקום לאוכלוסיית whitely גדלה.
תוצאות טובות התקבלו עם שימוש באורגנזה אורגנית יחד עם רשת אלומיניום, וכן עם רשת לבנה. בחירת מין הצמח היא שיקול חשוב. ראשית, עליו להיות בעל צמיחה מהירה, אך לא לגדול עד כדי השתלטות על התא. שנית, על הצמח להיות חסון מספיק כדי לתמוך באוכלוסיית חרקים גדולה מבלי לקרוס.
מסיבות אלו, זני ננס או זני שיח מהווים בחירות טובות של צמחים. שלישית, על הצמח להיות מסוגל לארח, או לחלופין לא להיות מסוגל לארח, את הנגיף המשמש, בהתאם לסוג המושבה המגודלת. מכיוון שהמושבה עלולה לקרוס עקב קרדיות, THPs, זבובים לבנים ברים או חרקים פולשים אחרים, יש לגדל את הזנים הנבחרים בסביבה מוגנת כדי למנוע כניסת חרקים אחרים.
הסיקינידים הראשונים של מושבה חדשה חייבים להיות נקיים מנגיפי צמחים, מחרקים אחרים ומפתוגנים של חרקים. אם הסיקינידים נאספים מהשדה, יש לגדלם למשך שמונה שבועות לפחות על צמחים שאינם מארחים של הנגיף במהלך תקופה זו, תוך בדיקה שאין תסמינים בצמחים. לאחר השגת סיקינידים נקיים, יש להחדיר בין 20 ל-100 מהם לכלוב צמחים באמצעות שאיבה או על ידי ניעור עדין מצמח מקור אחר.
בכל שבוע יש להקים כלוב חדש. במהלך שלושת השבועות הראשונים, השתמשו בבמסיות על צמחים שאינם ST כדי להקים את הכלוב החדש. החל מהשבוע הרביעי, השתמשו בבמסיות בוגרות צעירות מהכלוב בן השלושה שבועות כדי להקים את הכלוב הבא.
במהלך השבוע הראשון בכלוב, הכנימות הלבנות יטילו ביצים על הצדו התחתון של פני העלים בצמח. בשבוע השני, כנימות לבנות לא בשלות יהיו גלויות, וחלק מהבוגרים עדיין יהיו בחיים. בשבוע השלישי, כנימות לבנות בוגרות רבות יבקיעו, וצפויה עלייה בולטת מאוד באוכלוסיית הכנימות הלבנות הבוגרות.
ניתן להשתמש בקישואנים לבנים אלו לניסויי הדבקה. בשבוע הרביעי, יש להעביר את הבוגרים בני השבוע למכלב חדש. יש להסיר את המכלב הישן ולהשליך את הצמחים שבו. מדויק.
העברה עדינה של כינמאים מבוצעת באמצעות מכשיר שאיבה ומבחנות איסוף; לעולם אין לשאוב בחוזקה. כינמאים הניזונים מצמחים בעת ההעברה מוטמעים בצמח וגופם יישבר אם יימשכו ממנו, מה שיהפוך את הכינמה לבלתי שמישה. כדי לאסוף את הכנמאיים, החזקו ביד אחת מגן פלסטיק צהוב בתוך כלוב המושבה ובשנייה את מכשיר השאיבה.
הקישו בעדינות על הצמחים כדי לעודד את הקישוטות הבוגרות לעוף. הקישוטות יימשכו לכרטיס הצהוב, שם ניתן לאסוף אותן. בעזרת השואב ובשאיבה עדינה מאוד, העבירו לא יותר מ-20 קישוטות לכל מבחורת איסוף.
לאחר מכן, הקפישו את המבחנה כדי לבלבל את הזבובים ואטמו אותה עם Parafilm. כדי להבטיח העברה ויראלית מוצלחת, העבירו בין 15 ל-40 בוגרים צעירים מצמחים נגועים בנגיף לצמחים בריאים, בהתאם לנגיף ולצמח המארח. פרוטוקולים אחרים, כגון סריקת עמידות, דורשים אוכלוסיות התחלה גדולות יותר.
במקרה זה, נערו את הצמחים הנדבקים בנגיף, אשר נחושים בכינקנים, מעל לצמחים שיש להחדיר להם את הנגיף. לאחר שהכינקנים הונחו על צמח נגוע בנגיף, אפשרו להם להזין במשך 48 עד 72 שעות כדי לרכוש נגיפים המועברים באופן קבוע. זמן ממושך יותר בדרך כלל אינו מגביר את קצב ההדבקה של נגיפים המועברים באופן לא קבוע או באופן קבוע-חולף (semi-persistent).
תקופת גישה קצרה יותר לרכישה, של שעה עד יום אחד, תספיק עבור ניסויים הדורשים רכישה מעלים ספציפיים. ניתן להשתמש בכלובי תקיעה; הגדירו את הכלוב כך שהצד התחתון של העלה יהיה נגיש, ואל תשתמשו ביותר מ-10 נקבות של White flies לכל כלוב בקוטר 2.5 centimeter, אחרת שיעור ההעברה ירד עקב דחיסות. עבור חשיפת צמחים (inoculation), בחרו את הכלוב המתאים בהתחשב במספר הצמחים.
צמח אחד, למשל, זקוק רק לכלוב קטן שגדול ממנו במעט; עבור מספר צמחים, ניתן לבחור בין צינור PVC קטן יותר, כלוב בעל מסגרת, או כלוב בעל מסגרת אלומיניום גדולה יותר. ככל שהמרחב סביב חלול הצמח קטן יותר, כך התוצאה טובה יותר. לאחר הוספת הקינים הלבנים לצמח החדש, משך הזמן הדרוש להחדרה תלוי בנגיף ובצמח המאכסן.
בדומה לרכישת הנגיף, משך הזמן הנדרש להעברה תלוי באופן ההעברה. העברה שאינה עמידה (non-persistent) דורשת זמן גישה קצר בהרבה מאשר העברה חצי-עמידה (semi-persistent) או העברה עמידה (persistent). ודאו שהפשפשי לבנים בודקים את הצמח או ניזונים ממנו במהלך תקופת הגישה להדבקה.
פתחו את הכלוב ובדקו את הצד התחתון של מספר עלים בכל צמח. עבור תקופות הדבקה ממושכות, השתמשו בגירויים עדינים של הצמחים מדי פעם כדי לעודד את הפיזור מחדש שלהם על הצמחים.
פעולה זו תגדיל את קצב ההדבקה על ידי מניעת הנטייה הטבעית של הכנימות הלבנות להתרכז עם סיום תקופת ההדבקה. השמידו את הכנימות הלבנות באמצעות שני קשרי חרקים שיוחלו one after the other. ראשית, השתמשו בחומר הדברה במגע כדי להשמיד במהירות את הכנימות הלבנות הבוגרות, כגון סבון להדברת חרקים.
שנית, יש להשתמש בחשבון קוטר חרקים סיסטמי כדי להשמיד זבובים לבנים שיתפתחו בשבועות הבאים. לצורך הדברת הבוגרים שנותרו, Imidacloprid או Pyrazosulfuron הם אפשרויות יעילות. באמצעות נהלים אלה, ניתן להשיג באופן שגרתי שיעורי העברה של נגיפים של 100%. שיעורי העברה גבוהים כל כך הם חיוניים בעת סריקת צמחי ניסוי לעמידות לנגיפים, ורצויים כאשר מעריכים את יעילותם של תרכובות כימיות ביכולתן להפריע להעברת נגיפים.
לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלים להבנה טובה של אופן גידולם של קישואנים לבנים (white flies) ושימוש בהם להעברת וירוסים של צמחים. ניתן להשתמש בנהלים אלו למטרות מחקר, לפיתוח מסחרי של צמחים עמידים לווירוסים, או לבדיקת תרכובות לבחינת יכולתן להפריע להעברת הווירוס.
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בהעברה של נגיפי צמחים באמצעות הכנימה הלבנה, Bemisia tabaci. הוא מפרט את השיטות לגידול כנימות לבנות בסביבה מבוקרת כדי להבטיח שיעורי העברה גבוהים של נגיפים לצמחים לבדיקה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- וירולוגיה של צמחים
- ניהול וקטורים של חרקים
- אנטומולוגיה
רקע
- ההעברה של נגיפי צמחים באמצעות חרקים כרוכה באינטראקציות מורכבות בין חרקים, נגיפים וצמחים.
- קישואנים לבנים (Whiteflies) מהווים וקטורים משמעותיים עבור נגיפי צמחים שונים בעלי חשיבות כלכלית.
- העברה מוצלחת של נגיפים דורשת ניהול קפדני של מושבות קישואנים לבנים.
- זיהום על ידי פתוגנים וחרקים אחרים עלול לפגוע באיכות הניסויים.
מטרת המחקר
- לבסס שיטות יעילות לגידול קישואנים (whiteflies) לצורך ניסויי העברת נגיפים.
- למטב את התנאים להשגת שיעורי העברה גבוהים של נגיפים לצמחים הנבדקים.
- להדגים את הפרוצדורות לתחזוקת מושבות בריאות של קישואנים.
שיטות מעבדה שנעשה בהן שימוש
- הקמה של מושבות קישואן לבן בחדרי גידול מבוקרים.
- העברה שוטפת של בוגרים שזה עתה בקעו לצמחים למסורב.
- ניטור תנאים סביבתיים כגון לחות, טמפרטורה ותאורה.
- שימוש בזני צמחים ספציפיים לתמיכה באוכלוסיות הקישואן הלבן ובהעברת הנגיף.
תוצאות עיקריות
- הושגו יעילויות של שיעורי הדבקה קרובים ל-100% באמצעות אופטימיזציה שיטתית.
- שמירה על תנאים נקיים הפחיתה משמעותית את הסיכון לזיהום.
- נקבעו פרוטוקולים ספציפיים להעברה וניהול של קישריות (whiteflies).
- הוכשרו רכישת נגיף והדבקה מוצלחים באמצעות קישריות בוגרות צעירות.
מסקנות
- גידול וניהול יעילים של קישואנים לבנים הם קריטיים למחקרים מוצלחים של העברת וירוסי צמחים.
- תנאים סביבתיים מבוקרים משפרים את האיכות ואת המהימנות של הניסויים.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על שיטות אלו כדי לבחון אינטראקציות אחרות בין צמחים, וירוסים ווקטורים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הקמה של מושבות יציבות של קישואנים לבנים מאפשרת העברה עקבית של נגיפי צמחים לצורך סריקה של תרכובות אנטי-ויראליות ותוכניות לגידול עמיד. העברה בעלת יעילות גבוהה תומכת בביטחון חיזוי באימות מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים של מועמדים לטיפול מבוסס צמחים. שיטה זו מספקת מערכת ניתנת להרחבה ולשחזור להערכת אינטראקציות בין נגיף למארח בתהליכי גילוי מוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של אינטראקציות בין וירוס, מאכסון ופתוגן כדי להבהיר מסלולים מכניסטיים בהעברת וירוסים בצמחים.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי אספקת מערכת וקטורים מבוקרת לתיקוף פונקציונלי של מטרות.
- ערך חיזוי: מסייע במיון פורטפוליו באמצעות הדבקה סטנדרטית של וירוסים לצורך סריקת עמידות ובדיקת יעילות של תרכובות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות מתוהקות לסריקה אנטי-ויראלית המשך עם מדדי העברה מדידים.
- ערך תפעולי: הבטחת סטנדרטיזציה של הבדיקה וחזרתיות באמצעות פרוטוקולי תחזוקת מושבות הממזערים שונות.
- מדרגיות: מאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה והרחבה לצורך הערכה בסריקה רחבה (high-throughput) של מעכבים כימיים או זנים עמידים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשר בין מחקרי העברת נגיפים בשלב הגילוי להערכה פרה-קלינית של תכונות עמידות או תרכובות אנטי-ויראליות.
- קידום מותאם סיכונים: תומך בהחלטות של המשך או עצירה (go/no-go) על ידי הדגמת העברה עקבית של נגיפים בתנאים ניסויים שונים.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מתמקד בערך הניבוי להבנת הגורמים הקובעים את יעילות ההעברה לצורך פיתוח תרופות אנטי-ויראליות.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
ממצב את העברת הנגיף באמצעות כינמון לבן כטכנולוגיה מאפשרת, משלב הגילוי ועד לשלב הפרה-קליני, לצורך תיקוף מטרות אנטי-ויראליות והבנת מנגנוני עמידות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות לגבי מנגנוני רכישה והחדרה של וירוסים באמצעות חשיפה מבוקרת לווקטור.
- סריקה: מספק מערכות מוכנות לבדיקה בעלות יעילות העברה גבוהה לצורך הערכה אמינה של תרכובות או גנוטיפים.
- אנליטיקה: מספק נתונים כמותיים של שיעורי העברה המאפשרים השוואה של יעילות אנטי-ויראלית או חדירות עמידות.
- מחקר תרגומי: מגשר בין שלבי הגילוי המוקדמים לאישור פרה-קליני על ידי הבטחת עקביות בהעברת הווירוס במסלולי רבייה לעמידות.
- שימוש חוזר ארגוני: מקיים פלטפורמת וקטורים לשימוש חוזר, הישימה על פני מערכות וירוס-מארח מרובות בביוטכנולוגיה חקלאית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במחקרי העברה של נגיפים.
- ערך תפעולי: מספק סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת הרחבה באמצעות פרוטוקולים מוגדרים לתחזוקה והעברה של מושבות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטאות מסוג go/no-go ואת יעילות ההון על ידי הפחתת הסיכון הביולוגי בקמפיינים של סריקת תרופות נוגדות נגיפים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד עדיפויות מותאם סיכון של תכונות עמידות או תרכובות בהתבסס על נתוני חשיפה עקביים לנגיפים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באנטומולוגיה, וירוסים של צמחים וטכניקת סטריליזציה לשמירה על שלמות המושבה.
- תלוי בחדרי גידול מבוקרים עם בקרות מדויקות של טמפרטורה, לחות, תאורה ואוורור.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של נהלי הטיפול בכיניקונים, השאיבה וההעברה.
- כולל שיקולי התאמה עבור שילובי וירוס-מארח שונים וביוטיפים שונים של כיניקונים.
- כולל מגבלות מעשיות כגון הדרת פתוגנים, פראזיטואידים וחרקים מתחרים כדי לשמור על נאמנות המושבה.
