פרופיל Proteome חיזור תיאול באמצעות תיוג איזוטופ ספקטרומטריית מסה

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לבחון את ההשפעות של pseudomona siro PV tomato על חלבונים המווסתים על ידי רדוקס בצמחי עגבנייה. ראשית, יש להחדיר לצמחי העגבנייה את pseudomona siro PV PV tomato כדי להשרות זיהום פתוגני ותגובה חלבונית. לאחר מכן, יש לצבוע ב-DIAM benzine כדי לצפות בשינויים במיני חמצן רב-פעילות.

לאחר מכן, בצעו סימון TMT של ציסטאין כדי לבחון ציסטאינים המהווסים על ידי רדוקס בחלבונים. התוצאות שיתקבלו יכולות למדוד שינויים בין דגימות מטופלות לדגימות ביקורת. שלום, אני Chen מהמחלקה לביולוגיה וממרכז הפרוטאומיקה כאן באוניברסיטת פלורידה.

היתרון של סימון ה-CTMT שלנו על פני שיטות קיימות, כגון תגי סנפיר מצופים באיזוטופים, הידועים גם כ-ASCA, הוא היכולת לבצע ריבוי דגימות (multiplexing) תוך כדי ניתוח של חלבונים המגיבים לחמצון-חיזור (redox responsive proteins) בקנה מידה רחב. בעוד שהדגמה זו תספק תובנות לגבי חלבונים מוסדרים על ידי חמצון-חיזור בעגבנייה בתגובה לזיהום בפתוגנים, ניתן להחיל את הניסוי על מערכות אחרות כגון joof, עכברים וצמחים אחרים, וכן על בקרה של תנאי עקה. הרעיון לשיטה זו עלה תחילה לאחר שהבחנו בשונות ניכרת בין ניסויי ICAD, מכיוון שרק שני תגים זמינים.

הדגמה של שיטה זו ב-VIR היא קריטית, כיוון ששלבי הסימון וההעשרה קשים ללמידה. יש למזער וריאציות ניסיוניות בין הדגימות המסומנות ולהפחית את הסרת האזורים כדי להבטיח סימון יעיל, בואו נתחיל. גדלו שני שתילים מושתלים של עגבנייה בגודל דומה בעציצים בעבוד של ארבעה אינץ' עבור תרבית האינוקולום.

מדשאה של *Pseudomonas syringae* על מצע KBM. גרדו את החיידקים לתוך 20 milliliters של מים והכינו תמיסת חידוע חיידקית בריכוז של כ-10⁶ colony forming units per milliliter. טבולו את הצמחים בני גיל ארבעה שבועות למשך 30 שניות בתוך תמיסת חידוע חיידקית המורכבת מליטר אחד של באפר חידוע.

לאחר מכן, כסו מיד בשקיות פלסטיק שקופות. לאחר זמן ההחדרה המועדף, קצרו את העלה הפתוח לחלוטין, הניחו את הצד האפידרמלי כלפי מעלה ב-1 mg/mL של צבע DAB, ובצעו חדירה בוואקום למשך 15 דקות. לאחר מכן, דגרו את העלים בחושך בטמפרטורת החדר למשך לילה.

כעת הרתיחו את העלים הצבועים ב-95% ethanol למשך 10 דקות ואחסנו אותם ב-75% ethanol. השחקו את העלים שנאספו לאבקה דקה בעזרת מכתש בתוך חנקן נוזלי. לאחר מכן, בצעו מיצוי פנול כפי שמתואר בטקסט הנלווה.

בשלב הבא, שקיע את החלבונים שהופקו באמצעות פנול בעזרת חמישה נפחים של 0.1 molar ammonium acetate קר ב-100% methanol. אסוף את החלבונים באמצעות צנטריפוגה ובצע שטיפות למשקע. לאחר מכן, השהה מחדש את הדגימות ב-1.5 milliliters של 70% ethanol קר והעבר אותן לפרועת מיקרו-צנטריפוגה בנפח של שני מיליליטר.

לאחר סבב צנטריפוגה, השליכו את העלייה (supernatant) של האתנול ויבשו את המשקע קצרה ב-speed vac. המיסו את הדגימות בבופר להפקת חלבונים דנטורטיבי; לאחר צנטריפוגה ליצירת משקע, אספו את העלייה ומדדו את ריכוז החלבון בהתאם למדריך היצרן. עבור כל אחד מששת תגי המסות, התחילו עם 100 µg של דגימת חלבון בנפח שווה של בופר אלקיליזציה של 200 mM IO acetamide שהוכן טרי, כדי לחסום את קבוצות הטיול החופשיות; דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה. לאחר מכן, כדי להשקיע את החלבונים, הוסיפו 1 mL של אצטון קר בריכוז 80% והניחו בטמפרטורה של -20 °C למשך לילה.

שקעו את החלבון באמצעות סנטריפוגציה ובצעו שלושה שטיפות עם 80% acetone. לאחר ייבוש הדגימות באוויר על קרח, השעיקו שוב את המשקע ב-50 µL של lysis buffer. לאחר מכן, כדי להפחית את קשרי הדיסולפיד, הוסיפו 0.5 µL של 100 mM TCEP והד기로 למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.

המס את התגים על ידי הוספה של 20 µL של acetonitrile למבחנות הריאגנטים. ערבב במערבל Vortex וסבב במ centri-fuge כדי להשקיע את הנוזלים. כדי להסיר TCEP עודף, העמס 50 µL של דגימה על עמודת MicroCon 3 KD. הוסף 50 µL של lysis buffer וסבב במערבל צנטריפוגה למשך 15 דקות ב-10,000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C.

כדי לאסוף את הדגימה, הוצא את העמודה, הפוך אותה לתוך מבחנה נקייה וסבב בצנטריפוגה. בדוק את ה-pH של הדגימה במידת הצורך. כוון את ה-pH לערך שבין שבע לשמונה באמצעות חומצה כלורידית בריכוז one molar.

הוסיפו 5 µL של ריאגנט TMT של הציסטה והדרימו את התגובה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר, ערבבו את הדגימות והוסיפו נפח שווה של באפר לדגימות (sample buffer), הרתיחו למשך חמש דקות והפרידו על ג'ל פוליאקרילאמיד (poly acrylamide) בכיסוי של 12% שיוצר מראש. לאחר שטיפת הג'ל שלוש פעמים במים מסוננים, צבעו ב-Coomassie Blue למשך שעה והשאירו להשריה במים למשך לילה, בהתבסס על ריכוזי פסי החלבון. חלקו את הג'ל ל-12 פראקציות לכל נתיב (lane). חתכו כל פראקציה לחתיכות של 1 mm והעבירו למבחנה של 1.5 mL.

השרו את חתיכות הג'ל לחלוטין ב-0.1 molar ammonium bicarbonate ב-50% acetonitrile. כעת, כסו את החתיכות ב-100% acetonitrile למשך 15 דקות. הסירו את הנוזל ויבשו את החתיכות באמצעות speed vac.

בשלב הבא, הוסיפו נפח שווה של תמיסת tripsin והניחו על קרח לרהידרציה. לאחר מכן, דגרו בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 12 עד 16 שעות לעיכול על ידי tripsin. לאחר מכן, הסירו את תמצית החלבון הנוזלית מהדגימות שעברו דגירה.

עצרו את התגובה והסירו שאריות של עיכול חלבונים על ידי כיסוי חלקי הג'ל ב-5% formic acid, 50% aceto nitrile. לאחר מכן, נערו את חלקי הג'ל למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. העבירו את הנוזל העליון למבחנות דגימות החלבון המופקות לאחר שתי הפקות נוספות.

ייבשו את הדגימות באמצעות SpeedVac באנבונות של 0.5 מיליליטר. הכינו ת сусפנסיון (slurry) של 50% שרף anti-TMT ב-TBS בריכוז הפרופורציונלי לעוצמת פס החלבון המתאים. שטפו את השרף שלוש פעמים בנפח עמודה אחת של TBS בריכוז 1x, ולאחר מכן הוסיפו 200 מיקרוליטר של TBS לכל דגימה.

לאחר מכן, העבירו לשרף anti-TMT וערבבו בטמפרטורת החדר למשך שעתיים, ולאחר מכן הניחו לערבול איטי (rocking) למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. העמיסו כל דגימה על עמודה. בצעו שטיפות עמודה של 200 µL כל אחת.

לאחר מכן, בצעו אלucian לכל דגימה שלוש פעמים עם 200 µL של elution buffer בריכוז 50% והייבשו תחת ואקום. לאחר מכן, השעו את הדגימות ב-12 µL של aceto nitrile בריכוז 3% עם 0.1% formic acid והזריקו 5 µL ישירות לעמודת HPLC. בצעו אלucian של הפפטידים באמצעות גרדיאנט של aceto nitrile בריכוז עולה, כמפורט בטקסט הנלווה.

השתמשו בספקטרומטריית מסה כדי לזהות פפטידים במסלול עבודה של top two by three. התחילו ב-ms של שלב יחיד. לאחר מכן, רכשו שלושה ספקטרא של Ms.Ms עם פרגמנטציה ב-higher energy C trapped dissociation, ולאחריה שלושה נוספים.

MS/MS עם דיסוציאציה בהשראת התנגשות לזיהוי חלבונים. נתח את נתוני ספקטרומטריית המסה באמצעות זרימת עבודה מסועפת. השתמש בקוונטיזר ברזל של דיווח (reporter iron quantizer) כדי לכמת את היחס.

בנוסף, עבדו את ספקטרום ה-MSM MS באמצעות צמתי הבחירת ספקטרום (spectrum selector), נרמול ספקטרום (spectrum normalizer) וקיבוץ ספקטרום (spectrum grouper), ובצעו שאילתת נתונים מול מנוע החיפוש seaquest. תמונה זו מציגה דוגמאות של עלה צמח עגבנייה במערך ביקורת משמאל ועלה שזוהם ב-pseudomonas מימין, לאחר צביעת העלים באמצעות DAB. תהליך צביעת ה-DES מאפשר לצבע ההיסטוכימי להראות סימנים של רדיקלי חמצן (reactive oxygen species) ברקמת העלה.

כפי שצפוי, הביקורת אינה מראה צביעה משמעותית, בעוד שהעלים שטופלו ב-pseudomonas נצבעים באופן חיובי לייצור מימן פרוקסיד. דוגמה זו מציגה פלט של נתוני גילוי פרוטאומי, שבו שטח שיא של חלבון המוסדר באופן דיפרנציאלי על ידי רדוקס עבור כל דגימה מאפשר כימות מוחלט. שטח השיא בין דגימות הביקורת לדגימות המוחדרות מעיד על כמויות יחסיות.

כאן, הוויסות הרדוקס של חלבון בין דגימה של ביקורת לדגימה מוחדרת הוא דומה. שיאים בעוצמה דומה מרמזים על נוכחות של קשרי דיסולפיד שאינם מושפעים מהשינוי בטיפול. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו כראוי בתוך שבוע.

זכרו לשמור על הדגימות קרירות ולשמור על סדר בתוויות. כמו כן, נקטו באמצעי זהירות בעת שימוש בפנול, כגון חבישת כפפות עמידות ועבודה תחת מנדף בהתאם להנחיה זו. ניתן לבצע מדדים נוספים, כגון אנליזה ספציפית של מספקטרומטריה למסות של מודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות, כדי לקבוע מודיפיקציות מערכתיות אחרות, כגון חומצה אולית וסימולציית גלוטן.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן ביצוע הפעלת DIB standing CTMD וכיול redox 16.