Assay Chemotaxis סי אלגנס
27 באפריל 2013
שיטת הערכת כמותית תגובת chemotactic של Elegans Caenorhabditis מתואר. מדד chemotactic (CI) הועסק כדרך להעריך בדיוק את התגובה של תולעים למטרות מסוימות, ומשמש כפלטפורמה להשוואה בין זנים ותרכובות של עניין.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לכמת את התגובה הכימוטקטית של C elegance באמצעות בדיקה פשוטה וזולה. זה מושג על ידי בידוד תולעים מתוזמנות והצבתן במרכז צלחת מסומנת. במרחק שווה מכל אתרי הבדיקה והשליטה שהופקדו בכל אתר נמצא תרכובת מעניינת או תרכובת בקרה, שתיהן בשילוב עם חומר הרדמה שירתק את התולעים כשהן מתקרבות.
לאחר 60 דקות, מונה את התפלגות התולעים הסופית על הצלחת, והיחס בין מיקומי התולעים משמש כדי לספק מדד בדיקה. בסופו של דבר, כימות המשיכה של ים האלגנטיות לתרכובות מסוימות יכול לשמש להערכת התוצאות ההתנהגותיות של מניפולציות ניסיוניות בסיסיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא כוללת היבטים מועילים רבים של קודמותיה, תוך אפשרות לשימוש נוח יותר.
בדיקה זו מספקת תובנה לגבי התנהגות ים האלגנטיות והיא שימושית במיוחד בשילוב עם מניפולציות נוירוגנטיות ובדיקות נוירוביולוגיות אחרות. התחל עם צלחות של חמישה סנטימטרים העמוסות באגר כימוטקסי או NGM. סמן את החלק התחתון של הצלחות לארבעה רבעים שווים.
הכן לפחות שלוש צלחות לפחות לשלושה ניסויים לכל זן גנטי שנבדק ולכל מצב שנבדק. לאחר מכן, סמן עיגול ברדיוס של 0.5 סנטימטר סביב המקור. לאחר מכן סמן נקודות ברבעים הנגדיים עם T לבדיקה או C לבקרה, וודא שהאתרים רחוקים שווה ממקורם זה מזה.
הנקודות חייבות להיות במרחק של לפחות שני סנטימטרים מהמקור לצורך בדיקה זו. יש להכין תולעים צעירות מבוגרות בפיתוח מסונכרן על צלחות כימוטקסי בנות חמישה סנטימטרים. תולעים שנמצאות בשלבי פיתוח שונים עשויות להגיב באופן שונה לחומרים האנליטיים.
כתוצאה מכך, חשוב מאוד שכל התולעים המשמשות בבדיקה נמצאות באותו שלב התפתחותי. ברגע שהתולעים פינו מדשאה של OP 50 e coli, צמצמו שני מיליליטר של מאגר S בסיסי לצלחת. תפעלו את הצלחת כדי להכניס את כל התולעים לחיץ כדי לשטוף את התולעים.
צמצמו מיליליטר אחד מהתולעים בחיץ לתוך מבחנת מיקרו צנטריפוגה וצנטריפוגו אותם למשך 10 שניות. השתמשו בפיקו פיוג' ב-6,600 סל"ד, שאפו את הבסיל כפי שהוא, והשאירו את הגלולה של התולעים ללא שינוי. כעת יש לשטוף את התולעים האלו שלוש פעמים נוספות בשיטה זהה.
התחל בהוספת מאגר S בסילי לצינור והפוך את הצינור כדי להחזיר את התולעים לפתרון. לאחר הכביסה הסופית, צנטריפוגו את התולעים למשך 10 שניות נוספות ולאחר מכן שאפו את הסופרנטנט לנפח סופי של 100 מיקרוליטר. לאחר מכן, ודא צפיפות מספקת של תולעים על ידי צמצום שני מיקרוליטר מהתולעים השטופות מהגלולה לצלחת NGM.
חייבות להיות לפחות 50 תולעים, אך לא הרבה יותר מ-250 תולעים. אם יש יותר מדי תולעים, הגדל את נפח תמיסת ESP בזיליקום. ואם יש מעט מדי תולעים, סובב אותם למטה והשהה אותם בנפח נמוך יותר.
הנח את צינור התולעים בקובץ עשן. ברגע שהוכנו, התולעים טובות לשימוש בבדיקת כימוטקסי למשך שעה. ראשית, הכן את הפתרונות.
ערבבו את תמיסת הבדיקה על ידי שילוב נפחים שווים של התרכובת הנבדקת עם חומר ההרדמה 0.5 מולרי אזיד. לאחר מכן, ערבבו פתרון בקרה של הממס המשמש לדילול התרכובת הנבדקת עם 0.5 מולרי נתרן אזיד. עכשיו הכן צלחת בדיקה.
ראשית צמצמו שני מיקרוליטר של תמיסת תולעים מהגלולה על מקור צלחת הבדיקה. שנית, הוסיפו את החומרים הריחיים צמצמו שני מיקרוליטר מהתמיסה הנבדקת לשני אתרי T וצמצמו שני מיקרוליטר מהתמיסה הבקרה לשני אתרי T. ברגע שהתולעים וטיפות הריח נספגו בחומר האגר, החליפו את המכסים, הפכו את הצלחות והניחו 60 דקות לזמן הבדיקה.
לצורך
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה להערכה כמותית של התגובה הכימוטקטית של Caenorhabditis elegans באמצעות בדיקה פשוטה וכלכלית. הגישה כוללת מדידה של התפלגות התולעים בתגובה לתרכובות שונות, ובכך מספקת מדד כימוטקטי לצורך השוואה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התנהגותית
- בדיקות ניסוייות
רקע
- Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם מודל המשמש לחקר תגובות התנהגותיות.
- כימוטקסיס היא התנהגות קריטית שניתן להעריכה באופן כמותי.
- שיטות קודמות היו חסרות דיוק וקלות שימוש.
- מחקר זה נועד לשפר את הטכניקות הקיימות להערכת תגובות כימוטקטיות.
מטרת המחקר
- לכימות התגובה הכמוטקטית של C. elegans לתרכובות שונות.
- לקביעת מדד כמוטקטי מהימן להשוואה בין זנים ותרכובות שונות.
- לסייע בהערכת השלכות התנהגותיות הנובעות ממניפולציות ניסיוניות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד תולעים בשלבי התפתחות שונים לצורך הבדיקה.
- מיקום התולעים במרכז פלטה מסומנת.
- מיקום שווה מרחקים של תרכובות הבדיקה והביקורת בשילוב עם חומרי הרדמה.
- ספירת התפלגות התולעים לאחר 60 דקות לחישוב המדד הכיmotקטי.
תוצאות עיקריות
- הבדיקה מכמתת ביעילות את המשיכה של התולעים לתרכובים ספציפיים.
- התוצאות מספקות מדד כימותקטי ברור לצורך השוואה.
- השיטה מדגימה קלות שימוש בהשוואה לטכניקות קודמות.
- ניתן להעריך את ההשלכות ההתנהגותיות של תגובות התולעים על בסיס התוצאות.
מסקנות
- השיטה שפותחה מציעה דרך מהימנה להערכת התנהגות כימותקטית ב-C. elegans.
- גישה זו יכולה לשפר את ההבנה של תגובות התנהגותיות בהקשרים ניסויים שונים.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על שיטה זו כדי לבחון תרכובות ותנאים נוספים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות של תגובות כימוטקטיות באורגניזמי מודל מאפשר תיקוף של מטרות בשלבים מוקדמים על ידי קישור מניפולציות גנטיות או פרמקולוגיות לתוצרי התנהגות מדידים. בדיקה זו תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בגילויים במדעי העצבים, על ידי מתן קריאה כמותית וניתנת לשחזור של תפקוד מסלולים תחושתיים. הפשטות והיכולת להרחבה (scalability) של הבדיקה מגבירות את הביטחון החזוי במחקרי מעורבות מטרה (target engagement) לפני זיהוי המולקולה המובילה (lead identification).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי קישור תפקוד גנים להתנהגות חושית בהקשר של אורגניזם שלם.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף של מטרות תפקודיות באמצעות פנוטיפ תנהגותי כמותי.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי הפחתת סיכונים של מטרות על בסיס פנוטיפים כימותקטיים ניתנים לצפייה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר פלטים כמותיים וסטנדרטיים המתאימים למסעות סריקת תרכובות.
- ניתנות להרחבה: תכנון בעל ארבעה רבעים מגדיל את גודל המדגם ומפחית הטיות, מה שמאפשר בדיקות שכפול אמינות.
- שילוב בזרימת העבודה: מאפשר הפעלה ללא השגחה ודירוג נקודת סיום, ובכך משפר את התפוקה בקווי גילוי.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- רציפות תרגומית: מקשר בין ממצאים גנטיים לתוצרי התנהגות, ובכך תומך בתיקוף של מודלים הרלוונטיים למחלה.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבהירה את תפקוד המסלול באמצעות תגובות כימוטקטיות התלויות במינון ובגנוטיפ.
- הלימה פרה-קלינית: מאפשרת להעריך השלכות התנהגותיות הנובעות ממודולציה של מטרה במערכת ניתנת לטיפול גנטי.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline) וזרימה
הבדיקה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזת המטרה ועד לאופטימיזציה של המולקולה המובילה (lead optimization), על ידי אספקת קריאה התנהגותית פונקציונלית המעידה על מהימנות המטרה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות באמצעות כימות תגובות התנהגותיות לתרכובות או לשיבושים גנטיים.
- סריקה: מספק מדדי כימוטקסיס כמותיים וניתנים לשחזור, המאפשרים השוואה בין תנאים וזנים שונים.
- אנליטיקה: מייצר מדד כימוטקסיס מנורמל (−1 עד +1) המקל על השוואת נתונים והערכה סטטיסטית.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מניפולציות נוירוגנטיות לתוצאות פנוטיפיות, ובכך תומך בתרגום של מטרה להתנהגות.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה מבחן התנהגותי מודולרי וזול, הניתן להתאמה למספר פרויקטי גילוי.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף מטרות על ידי צמצום העמימות בפנוטיפים התנהגותיים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות שלבי התפתחות תולעים סטנדרטיים, הכנת פלטות ודירוג עיוור.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לקבלת החלטות מוקדמות של go/no-go המבוססות על נתוני התנהגות תפקודיים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בקידום מותאם סיכונים על ידי זיהוי מטרות בעלות תיקוף פנוטיפי חזק in vivo.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול בתולעים, סנכרון וקביעת שלבי התפתחות.
- תלוי בציוד מעבדה סטנדרטי הכולל צנטריפוגות, מבחנות למיקרוצנטריפוגה ואינקובטורים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של הכנת התולעים ותזמון הבדיקה על מנת להשיג תוצאות הדירות.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש התאמות בעיצוב הזירה ובתאימות של חומרי ההרדמה.
- מגבלות מעשיות כוללות רגישות לצפיפות התולעים ולשונות בשלבי ההתפתחות, אותן יש לשלוט בהן.
