זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות שינויים לאחר תרגום של חלבונים המעורבים בקומפלקסים של חלבון צמחי המתבטאים תחילה באופן חולף או יציב בפלאנה, חלבון התגים המעניין. לאחר מכן מחלצים את סך החלבונים מרקמת הצמח, ומזרזים את החלבון המעניין. לאחר מכן, הפרד את החלבונים המשקעים החיסוניים על ג'ל אקרילאמיד וחלץ ולעכל את החלבונים מרצועת הג'ל המעניינת.

כעת שלח את דגימות החלבון לספקטרומטריית מסה. בסופו של דבר, התוצאות של ספקטרומטריית מסה יכולות לזהות שינויים דינמיים בשינויים שלאחר התרגום כגון זרחון. בניגוד לשיטות אלטרנטיביות כמו דגירה חוץ גופית של קינאז עם מצע, שיטה זו מבטאת חלבונים באדנית.

אז אתה לא צריך לדעת איזה קינאז אחראי לזרחון. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הצמח, כגון כיצד אותות מתמרים בתגובה ללחץ, שינויים סביבתיים או זיהוי פתוגנים. בנוסף לזיהוי זרחון, אתרים של קומפלקסים של חלבון עמיד מופעל, ניתן ליישם שיטה זו באופן נרחב על כל שינוי לאחר תרגום של כל קומפלקס חלבון צמחי.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהם לא רגילים לעבוד עם כמות גדולה של תמצית ולבצע שלבים נוספים של הפרוטוקול ביום אחד. לביטוי חולף, גדל את זני האגרובקטריום טוהין לשלב נייח. קצרו את חיידקי האגרו על ידי צנטריפוגה ב -3000 גרם למשך חמש דקות.

השעו מחדש את הכדורים ואת מאגר ההסתננות. מאגר. עכשיו מסתנן. NCOA בן ארבעה שבועות שותל חמאנה עם חיידקים חקלאיים באופן ידני באמצעות מזרק ללא מחט של מיליליטר אחד או בוואקום עם 0.02% חומר פעילי שטח, יומיים עד חמישה ימים לאחר ההסתננות.

קצרו את העלים, העלים שהסתננו, הקפיאו אותם בחנקן נוזלי ואחסנו במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן טוחן 20 גרם רקמת צמח וחנקן נוזלי באמצעות מכתש ועלי ב-80 מיליליטר של חיץ קר C עד 20 גרם. מערבבים היטב ומפשירים על קרח.

עכשיו הומוגניזציה עם שלושה פרצים של 10 שניות כל אחד במלוא המהירות. מסננים את ההומוגנאט והצנטריפוגה ב -30, 000 גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בינתיים ל-100 מיקרוליטר של מטריצת זיקה מתאימה ב-500 מיקרוליטר של מאגר חוסם קר D למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ונשטף שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של מאגר קר D.לאחר מכן, הסר את הסופרנט של תמצית העלים והעביר אותו דרך מזרק של 0.45 מיקרומטר.

מסננים לצינור חדש על קרח. ציטוט התמצית הגולמית. לכתם חיסוני.

הוסף חמישה מערבולת מאגר טעינת דפים XSDS והרתיח את הדגימות לדנטורציה. הוסף 50 מיקרוליטר של מטריצת הזיקה, התלויה במאגר D לכל צינור. דגירה בסיבוב עדין במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס, צנטריפוגה לכדורים את מטריצת הזיקה.

לאחר מכן קח מנה של התמצית הלא קשורה לכתם חיסוני. השליכו את שאר השפיות, והשאירו כ -500 מיקרוליטר בתחתית הצינור. השעו מחדש את תמיסת התרחיץ עם קצה קדח רחב.

אסוף את תמיסת התרחיץ המעורבת משני הצינורות לצינור יחיד של 1.5 מיליליטר. דופק שלוש פעמים למשך חמש שניות באמצעות צנטריפוגה שולחנית כדי לזרז את מטריצת הזיקה ולהסיר את הסופרנט לאחר שלוש עד חמש כביסות עם מיליליטר אחד של מאגר קר D.הסר את המאגר העודף D עם מחט מזרק עם 200 מיקרוליטר של מאגר הפליטה המתאים תחת ניעור מתמיד. משוך את שלושת ה-EIT בצינור אחד.

לאחר מכן רכזו את החלבונים באמצעות 30 מיקרוליטר של מערבולת שרף ספיגה. בואו נעמוד חמש דקות ונזרז את השרף, נזרוק את הסופרנט. הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר טעינת עמוד XSDS אחד למטריצת הזיקה המשקעת או למערבולת שרף הספיגה והרתיח במשך 10 דקות בטמפרטורה של 80 עד 100 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה של בלוק חום.

מטריצת הזיקה המבושלת היא שרף למשך שתי דקות ב 10, 000. GS מצטט חמישה מיקרוליטרים של הסופרנט לחסימה חיסונית ומריץ עם שברים אחרים על דף SDS באורך 10 סנטימטרים. ג'ל להפרדה וזיהוי חלבונים זרחניים על ידי ספקטרומטריית מסה.

טען את 45 המיקרוליטר הנותרים על כתם ג'ל דף SDS. ג'ל עמוד SDS עם כחול קמאסי קולואידי. ואז לעכב את הג'ל בכביסה ובמים בשפע, רצוי למשך הלילה.

כעת, בעזרת אזמל נקי, הוציאו את הרצועה המעניינת מהג'ל, חתכו את פרוסת הג'ל לקוביות של שניים עד ארבעה מילימטרים והעבירו את הדגימה לשפופרת. שוטפים את חתיכות הג'ל עם 50% אצטו ניטריל ו-50 מילי-מולרי אמוניום ביקרבונט עד להכתמה. ואז פיפטה מהתמיסה.

הקפדה לא להסיר חתיכות ג'ל. יבש את הדגימה עם 100% אצטו ניטריל למשך חמש דקות, והסר את הנוזל החופשי. לאחר מכן כדי להפחית את קשרי החלבון די סולפיד ב-10 מילי-מולרי DTT ולדגור במשך 30 עד 45 דקות ב-56 מעלות צלזיוס עם ניעור, הסר את הנוזל החופשי כעת לשאריות אלקילט ציסטאין.

הוסף 55 מילי-מולרי כלורו אצטמיד למשך 20 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. הסר את הנוזל החופשי ולאחר מכן שטוף את חתיכות הג'ל פעמיים עם 50% אצטו ניטריל למשך 10 דקות. הסר נוזל חופשי.

כעת ייבשו את חתיכות הג'ל עם 100% אצטו ניטריל למשך חמש דקות, והסירו את הנוזל החופשי לעיכול הטריפטיכון. ב-40 מיקרוליטר של תמיסת עבודה של טריפסין, אפשר לחתיכות הג'ל להתייבש למשך 10 דקות במאגר עיכול מספיק כדי לכסות חתיכות ג'ל. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לעצור את העיכול ולחלץ את הפפטידים מחתיכות הג'ל ב-5% חומצה פורמית סוניקט למשך חמש עד 10 דקות.

לאחר מכן העבירו את הסופרנט לצינור חדש, יבשו את הפפטידים על ידי ליופיליזציה או רכז ואקום, ואחסנו את הדגימות במינוס 20 מעלות צלזיוס. ניסוי זה מטהר את קומפלקס הקינאז P-R-F-P-T-O מנקואה האמנה, המנה טרנסגנית של NACOA המבטא 35 SPTO עברה טרנספורמציה זמנית עם דגל 35 SPRF, והקומפלקס הושקע חיסוני עם Anti-Flag M שני ארוס. הכתמים החיסוניים ממחישים משקעים חיסוניים יעילים של חלבון ה-PRF הממוקד, הן PTO והן חלבון האפקטור האינטראקטיבי מטוהר יחד עם PRF כפי שמצוין על ידי זיהוי נוגדנים וניתוח ספקטרומטריית מסה.

כאן, האסטרטגיה הייתה למקד את חלבון ה-PTO עם Anti-Flag. האסטרטגיה השתנתה. על מנת לזהות אתרי זרחון PTO.

הכמות הכוללת של חלבון PTO הכוללת הן את קומפלקס ה-PRF והן את הצורה החופשית הייתה מזורזת חיסונית עם Anti-Flag M two aros ונתונה לפיצול עמודי SDS, עיכול טריפטיכון אינגל וניתוח ספקטרומטרי מסה הביא לפפטידים של PTO המשתרעים על פני כ-80% מהרצף שלו. מעניין שזוהתה קבוצה של אתרי זרחון בודדים עבור פפטידים של PTO. שימו לב שאתרי זרחון כפול זוהו רק בנוכחות אחד מחלבוני האפקטור.

חשוב לקבל מספיק כמויות חלבון מהצומח על מנת לזהות רכיבים של קומפלקס חלבונים וגם לזהות שינוי לאחר תרגום של חלבון מעניין. זכור כי שינויים במיפוי כמו זרחון דורשים כמות סבירה של חלבון מספקטרומטריית מסה, כך שלפחות רצועה קלושה צריכה להיות ניכרת על הג'ל שלך לאחר הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו I, זיהוי של רכיבים מורכבים על מנת לענות על שאלות נוספות כמו כיצד הפעלת קומפלקס חיסוני מובילה לחסינות תפקודית.

אל תשכח שעבודה עם חוצצים אורגניים, חיידקים ו-BBL סכיני גילוח עלולה להיות מסוכנת ביותר, אז נקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות ומעילי ברכיים.