חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לעקוב אחר האינטראקציה בין שני חלבונים המתבטאים בעלי טבק שלמים. זה מושג על ידי תכנון מבנים מתאימים, מיזוג שני הגנים המעניינים לפיצול חלבונים פלואורסצנטיים והפיכת מבנים אלה לחיידקים אגרו. כשלב שני, תרביות אגרו חיידקים מעורבבות ומוזרקות לעלי טבק, מה שמוביל לביטוי החלבונים ולאות פלואורסצנטי משוחזר.

אם החלבונים מתקרבים זה לזה, לאחר מכן, עלים שלמים או פרוטופלסטים מבודדים מנותחים תחת המיקרוסקופ. מתקבלות תוצאות המראות אינטראקציות חלבון המבוססות על האות הפלואורסצנטי הנפלט שזוהה במיקרוסקופ פלואורסצנטי. היתרון העיקרי של טכניקה זו של שיטות קיימות כמו cor immunoprecipitation או שמרים להיברידיים הוא שניתן לנטר ישירות את האינטראקציה של חלבון החלבון בתא הצמח החי.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הצמח, כגון היווצרות קומפלקסים של חלבונים בתאים תאיים שונים. כדי להתחיל בהליך זה, גדל את חיידקי האגרו שישמשו לטרנספורמציה של עלי הטבק. לחסן 10 מיליליטר של מדיום LB המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה עם 50 מיקרוליטר של AG L תרבית מלאי גליצרול אחת המכילה את הפלסמיד המעניין בשפופרת סטרילית של 50 מיליליטר.

יש לדגור בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות, לנער במהירות של 190 סל"ד עד שהתרבית מגיעה ל-OD 600 בין 1.0 ל-2.0 למחרת. צנטריפוגה את החיידקים ב -3000 פעמים G למשך 15 דקות. לאחר השלכת ה-supernatant resus, השעו את הגלולה במדיום חדירה טרי והתאימו את המתלה ל-OD 600 של 1.0.

דגרו את תאי החיידקים האגרו-חיידקים בשייקר עילי למשך שעתיים בחושך בטמפרטורת החדר לחדירת עלי טבק. בחר כמה עלים ישנים יותר מצמח טבק בן שלושה שבועות. מערבבים נפחים שווים.

שלושה מיליליטר כל אחד מהחיידקים החקלאיים הנושאים את המבנים המעניינים. מלאו מזרק של חמישה מיליליטר ללא מחט בתערובת תרחיף התאים כדי לחדור את תרחיף התאים לעלי הטבק. לחץ בזהירות על המזרק בצד התחתון של העלים בכמה מקומות, השקה את הצמחים והשאיר אותם מכוסים ומוגנים מפני אור למשך יומיים.

כדי לבודד פרוטופלסטים מעלה שהסתנן, ראשית, הניחו את העלה בצלחת פטרי והוסיפו מעט תמיסת אנזים טרייה. בעזרת סכין גילוח חדש, חותכים את העלה לחתיכות בגודל של כ-0.5 סנטימטר רבוע. לאחר מכן, העבירו את חתיכות העלים עם תמיסת האנזים לוואקום.

בקבוק הסתננות. הסתננו בוואקום למשך כ-20 שניות עד שיוצאות בועות אוויר מהעלים. שחרר את הוואקום בזהירות רבה.

לנער את הבקבוק למשך 90 דקות בחום של 40 סל"ד בחושך בטמפרטורת החדר לאחר 90 דקות. שחרר פרוטופלסטים על ידי ניעור למשך דקה אחת ב 90 סל"ד. מסננים את התמיסה דרך גזה לצינור צנטריפוגה תחתון עגול של 15 מיליליטר.

שכבו את תמיסת הפרוטופלסטים עם שני מיליליטר של מאגר FPCN וצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-70 פעמים G עם האצה והאטה איטית בטמפרטורת החדר. פרוטופלסטים שלמים יצטברו בממשק בין תמיסת האנזים ל-FPCN באמצעות פתח רחב של קצה פיפטה של מיליליטר אחד, ויעבירו את הפרוטופלסטים השלמים לתוך צינור צנטריפוגה טרי. להצלחת הליך זה, השתמש תמיד בקצות פתח לבן כדי למנוע קרע של פרוטופלסטים שלמים.

מלאו את הצינור בצנטריפוגת חיץ W חמש למשך שתי דקות ב-100 פעמים G עם האצה והאטה איטית. כדי לגלול את הפרוטופלסטים, הסר את הסופרנטנט בזהירות והשהה מחדש את הגלולה. בכ -200 מיקרוליטר של W חמישה מאגרים, תלוי בכמות הפרוטופלסטים.

להכנת דגימת פרוטופלסטים לסריקת לייזר במיקרוסקופיה בקצב הראשון, שתי רצועות איטום קטנות במרחק של כשני סנטימטרים זו מזו על שקופית מיקרוסקופ. מניחים 20 מיקרוליטר מתמיסת הפרוטופלסטים בין הרצועות ומניחים בזהירות כיסוי מעל. רצועות האיטום ימנעו את ריסוק הפרוטופלסטים על ידי זכוכית הכיסוי.

להכנת דגימת עלה כוללת למיקרוסקופ סריקת לייזר, חותכים חתיכה של סנטימטר אחד מהעלה ומניחים אותה על שקופית מיקרוסקופ כשהצד התחתון של העלה פונה כלפי מעלה. מוסיפים כ -30 מיקרוליטר מים. הניחו כיסוי מעל וקבעו אותה היטב בעזרת סרט דבק משני הצדדים.

ההדמיה מתבצעת באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי מ-MICCA מסוג TCS SP 5 להגדלה. השתמש בעדשה אובייקטיבית בעוצמה של 63 x עם גליצרול כמדיום ההדמיה, השתמש בתוכנה פלואורסצנטית מתקדמת של חבילת היישומים של Leica להערכה. הגדר את לייזר ארגון ל-30% ואת עוצמת הלייזר ב-488 ננומטר לעוצמה של 18%כדי לנטר את האות שלו ב-515 ננומטר, הגדר את רוחב הפס הראשון של פליטת גלאי PMT מ-495 ל-550 ננומטר.

לניטור אוטופלואורסצנטיות של כלורופיל. הגדר רוחב פס פליטה שני של גלאי PMT מ-650 ל-705 ננומטר. כדי לנטר את אות הדובדבן M, השתמש בלייזר HENI 5 61.

הגדר את עוצמת הלייזר ל-18% ורוחב פס פליטה שלישי של גלאי PMT מ-587 ל-610 ננומטר. ודא שתמונות מכל ערוצי גלאי PMT מצולמות עם אותן הגדרות הגברה. הרווח צריך להיות בין 800 ל-900 כדי לא לכלול אותות רקע.

רכוש תמונות בפורמט זה, רוחב וגובה של 1024 על 1024 פיקסלים במהירות סריקה של 100 הרץ. עבור ערימות Z, השתמש במרחק מרבי של 0.5 מיקרון בין כל ערימה. במחקר זה, נעשה שימוש בשיטת BFC כדי לנטר את האינטראקציה של המלווה המולקולרי הציטוזולי HSP 90 עם חלבוני העגינה של הממברנה TPR 7 ו-64.

כפי שמוצג בסכימה זו, נוגה מחוברת לחלק הציטוזולי של TPR 7, השוכן ברטיקולום האנדופלזמי או ל-64, השוכן במעטפת החיצונית של הכלורופלסט. Hs.P 90 הוא N מותך באופן סופי ל-SCFP המאפשר אינטראקציה של תחומי ה-TPR של שיחה 64 ו-TPR 7 עם HSP 90 C, Terminus, SCFP לבדו מתבטא בציטוזול כבקרה שלילית כדי לאמת את הלוקליזציה של קומפלקס החלבון TPR 7 HS P 90. TPR 7 ו-HS P 90 עברו טרנספורמציה משותפת עם סמן ER.

הקרינה נוטרה בעלים שלמים כבקרה. SCFP לבדו בא לידי ביטוי יחד עם TPR 7 וסמן ER. בכל התמונות המוצגות, סרגל קנה המידה מייצג 10 מיקרון.

הפאנלים משמאל מראים פלואורסצנטיות משוחזרת בירוק המנוטרת ב-515 ננומטר. סמן המיון מופיע באדום. בפאנלים האמצעיים שכבת-על של שני האותות מוצגת בפאנלים הימניים.

אות משוחזר עבור TPR 7 יחד עם HS P 90 נוטר בחפיפה עם סמן ה-ER המופיע בצהוב. לעומת זאת, לא היה אות ל-TPR 7 והשליטה השלילית כ-CFP נוטרה. בדוגמה הבאה, חלבון הכלורופלסט tox 64 התבטא במשותף עם HS P 90 כביקורת.

Tox 64 התבטא במשותף עם SCFP בלבד. כמו קודם, פלואורסצנטיות משוחזרת בירוק נוטרה ב-515 ננומטר. הפאנלים האמצעיים מראים אוטופלואורסצנטיות של כלורופיל המנוטר ב-480 ננומטר.

באדום שכבת-על של שני האותות מוצגת בפאנלים הימניים. פלואורסצנטיות משוחזרת נצפתה בתאים המבטאים רעלן 64 ו-HSP 90, אך לא בתאים. Coex מבטא רעלן 64 ו-SCFP בלבד.

מכיוון שקשה לקבוע את הלוקליזציה המדויקת של טוקס 64 ו-HSP 90 בתמונות מיקרוסקופיות של העלים השלמים. פרוטופלסטים בודדו מעלי טבק שחדרו למיקרוסקופיה פלואורסצנטית. כמו קודם, נוטרה פלואורסצנטיות משוחזרת ב-515 ננומטר, אוטופלואורסצנציה של כלורופיל נוטרה ב-480 ננומטר ונוצרו תמונות שכבת-על כפי שמוצג בתמונת שכבת-על זו ל-64 וניתן לזהות HSP 90 כמבנים בצורת טבעת המקיפים את הכלורופלסט כבוי.

אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לעצב את המבנים שלכם, לשנות עלי טבק, וכיצד לדמיין בצורה הטובה ביותר את האות הפלואורסצנטי שמראה את האינטראקציה בין שני החלבונים המעניינים שלכם.