פשוט ומהיר פרוטוקול למדידת שומנים ניטרלי בתאי אצות באמצעות הקרינה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא למדוד את תכולת השומנים הנייטרלית של תאי אצות באמצעות צבע פלואורסצנטי אדום נילוס. זה מושג על ידי השעיית התאים בתמיסת אתנול כדי לחדור לדופן התא ולקרום התא. כשלב שני מתווסף צבע פלואורסצנטי אדום נילוס, שנכנס לתאים ומצטבר באזורים הלא קוטביים של התא, כולל גופי השומנים הנייטרליים.

לאחר מכן, הדגימות נחשפות למקור אור עירור של 530 ננומטר, מה שגורם לאדום הנילוס הנספג בגופי השומנים הנייטרליים להאיר ב-604 ננומטר. התוצאות מתקבלות בקנה מידה מסיבי על ידי ביצוע הבדיקות הפרטניות במכפיל מיקרו באר ושימוש בספקטרופוטומטר להפקת קריאות פלואורסצנטיות מהירות. הקריאות מראות קשר ליניארי בין תכולת השומנים הנייטרלית של תאי האצות לבין עוצמת מדידת הקרינה.

ניתן להשיג המרה של מדידות הקרינה לתכולת שמן באמצעות עקומת כיול שהוכנה עם תאים בעלי הרכב שמן ידוע. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני פרוטוקולים קיימים, כגון השיטה הגרבימטרית Bly dire, הוא שהיא מאפשרת קביעה מהירה של תכולת שומנים ניטרלית באמצעות חומרים הזמינים לרוב המעבדות. שיטה זו מספקת משוב מיידי על ביצועי התהליכים הביולוגיים במהלך גידול אצות.

כמו כן, התפוקה הגבוהה המותרת על ידי קורא הלוחות 96 Well היא אידיאלית למחקרי סינון וניסויים פקטוריאליים. למרות שטכניקה זו עברה אופטימיזציה עבור כלורלה ו-s Desus, ניתן לשנות אותה בקלות לניתוח של מיני אצות אחרים. בסדר. כדי להתחיל, הסר נפח דגימה מתרבית האצות הגדלה שיספק לפחות 200 מיליגרם של ביומסה יבשה.

עדיף 400 עד 600 מיליגרם. צנטריפוגה של הדגימה בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב-10,000 פעמים. G, השליכו את הסופרנטנט ושטפו את הגלולה בנפח שווה של מאגר פוספט שנוסח לאותו pH כמו אמצעי הגידול.

חזור על תהליך זה בסך הכל שלושה שלבי כביסה. השעו מחדש את הגלולה במים נטולי יונים והעבירו לצלחת שקילה מראש. הניחו לדגימה להתייבש בחום של 50 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.

ניתן לאחסן את תרביות האצות המיובשות בטמפרטורת החדר לשימוש עתידי. מדוד כ-50 מיליגרם של ביומסה של אצות יבשות בכלי מי גבינה. העבירו את הביומסה למרגמה שנשטפה מראש בהקסאן במידת הצורך, שטפו את כלי הגבינה בכמות קטנה של הקסאן בעזרת פיפטה בעבר על מנת להעביר לחלוטין את הביומסה לסדר המרגמה.

לאחר מכן, טוחנים את הביומסה של האצות במשך חמש דקות בעזרת עלי. התחל בטחינה עדינה והגביר בהדרגה את העוצמה. טוחנים את הביומסה לעיסה דקה וחלקה.

במהלך חמש הדקות, הוסיפו כמה מיליליטר הקסאן למרגמה וערבבו את השפלה המתקבלת עם העלי עד שהוא הומוגני. ודא שכל פסולת התא שנדבקה לדפנות המרגמה משתחררת ותלויה בנוזל. לאחר מכן, העבירו את תערובת המסה של תאי ההקסאן לצינור צנטריפוגה תואם.

חזור על הפעולה שלוש עד חמש פעמים עד שכל הביומסה הועברה לצינור הצנטריפוגה. צנטריפוגה של הדגימה בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ב-10,000 פעמים. ז. לאחר צנטריפוגה, פיפטה בזהירות את הסופרנטנט לתוך צלחת מתכת שקולה מראש, אותה ניתן לאחסן במכסה האדים.

בצע מיצוי הקסאן שני על ידי הוספת שלושה מיליליטר הקסאן לגלולה ומערבולת נמרצת. במשך דקה אחת, חזור על הצנטריפוגה והעברת הסופרנטנט. קבע את מסת השמן המופק בגרבימטריה לאחר שההקסאן התאדה לחלוטין.

לכימות פלואורומטרי, הכינו את כל דגימות האצות באותו ריכוז ביומסה ובאותו אופן כמו התקנים המשמשים למדידה. עשה זאת על ידי השעיית דגימות מיובשות מראש בכמות המתאימה של מאגר פוספט. במידת הצורך, השתמש בהומוגנייזר כדי להקל על השעיית החייאה של תאי אצות מיובשים.

לכל דגימה מערבבים 80 מיקרוליטר של תמיסת אתנול מוכנה של 30%, 10 מיקרוליטר של תמיסה מוכנה של אדום נילוס ו -10 מיקרוליטר של תרחיף אצות בבאר אחת של צלחת 96 בארות. על מנת להסביר כראוי את השונות של מדידת הקרינה, בצע חמישה שכפולים של כל דגימה. לאחר מכן, הפעל עקומת כיול של שתי נקודות עם תקנים שהוכנו בעבר.

על מנת לקחת בחשבון את השינויים היומיומיים במכשיר והכנה לביצוע מדידות הקרינה בספקטרופוטומטר קורא צלחות מרובה בארות, הגדר את הפרמטרים לרעוד ב-1, 200 סל"ד ולהקיף שלושה מילימטרים למשך 30 שניות, ולאחר מכן דגירה ב-40 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. רעידה נוספת ב-1,200 סל"ד והקפה של שלושה מילימטרים למשך 30 שניות, וכדי לתעד פלואורסצנטיות עם עירור ב-530 ננומטר ופליטה ב-604 ננומטר. לאחר מכן התחל את הריצה כשלב אחרון.

המר את מדידות הקרינה לתכולת שמן באמצעות התוצאות מהתקנים הפנימיים לביצוע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. השתמש בדגימה שהוכנה עם הכתם האדום של הנילוס להכנת שקופית מיקרוסקופ של דגימת התהליך על פי נהלי מעבדה סטנדרטיים. החל מהמיקרוסקופ במצב שידור, טען את השקופית המוכנה למיקרוסקופ ואתר את התאים בהגדלה הרצויה.

לאחר המיקוד, העבר את המיקרוסקופ ממצב שידור למצב תאורה פלואורסצנטי אפי. מקור האור אמור כעת להגיע ישירות מעדשת האובייקטיב, שניתן לאשר חזותית על ידי התבוננות ברווח בין השקופית לעדשת האובייקטיב. הכנס מסנן עירור ירוק למקור האור ומסנן פליטה אדום לנתיב אור התצפית.

הקרינה של התאים המוכתמים אמורה כעת להיראות ישירות דרך העינית. העבר את מצב התצפית של המיקרוסקופ מהעינית למצלמה המותקנת והשתמש בתוכנת צפייה כדי לצלם תמונה של תאי הפלואורסצנט. הגדרות ספציפיות ישתנו בהתאם למכשירים, ציוד וסוגי תאים.

תאי אצות מייצגים המוכתמים בצבע אדום נילוס מוצגות תמונות של פרוטה שגדלה בעודף חנקן מובילות להצטברות שומנים תוך-תאית נמוכה מאוד, המוצגות בניגוד לדגימות של OIDs הגדלים תחת מגבלת חנקן. תחת תאורת שידור, ניתן לדמיין את גופי השומנים של התאים בבדיקה מדוקדקת שבה הם מופיעים כמבנים עגולים מבריקים ומהווים את רוב נפח התא. התאים המוצגים כאן הם רק 5% שמן לפי משקל יבש ואינם מכילים רמות משמעותיות של גופי שומנים כאשר מראים להם את תנאי התאורה המתאימים.

ההבדלים בדגימות אלה מוגדלים. התאים הרזים בשמן מופיעים כטבעות פלואורסצנטיות עם גוף כהה, בעוד שהתאים העשירים בשמן מציגים זוהר אדום כתום בוהק במקום שבו הם צברו גופי שומנים. אדום הנילוס יזוהר באורכי גל שונים בהתאם לנוכחותם של שומנים ניטרליים, פוספוליפידים הממוקמים על דופן התא וחלבונים תאיים לא קוטביים, וזו הסיבה שתאי השמן הרזים מופיעים כטבעות פלואורסצנטיות עם גופים כהים.

אי ספציפיות זו היא גם מה שגורם לרמת הרקע של הקרינה במהלך מדידות הספקטרופוטומטר של השומנים הנייטרליים בתנאים האופטימליים של הבדיקה, עקומות כיול עם ערכי ריבוע R גדולים מ-0.980 ניתנות להשגה בקלות. הקשר בין תכולת שמן התא לפלואורסצנטיות הופך להיות לא ליניארי אם התאים מוכתמים בתמיסה, חסר ממס נשא כגון אתנול. לנתונים המוצגים כאן יש ריבוע R של 0.395, והם התקבלו על ידי ביצוע הפרוטוקול בתמיסת אתנול 0%.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 15 עד 20 דקות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לוודא שכל הדגימות מוכנות באותו ריכוז ביומסה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד את תכולת השומנים הנייטרלית של תאי lgal באמצעות פרוטוקולי מיצוי הקסאן מסורתיים והליך הצביעה הפלואורסצנטי הפשוט יותר של NAL אדום.