פלטפורמה חדשני מתיחה עבור יישומים בתאים והרקמות mechanobiology

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים את החידוש של פלטפורמת מתיחה איזוטרופית שניתן להשתמש בה כדי לחקור תגובות של תאים בודדים לעיוות מכני מורכב ולכמת את התכונות המכניות של רקמות ביולוגיות. זה מושג על ידי ייצור הממברנה הגמישה תחילה והרכבת הממברנה הזו על סט מהדקים. השלב השני הוא לתרבית C שני תאי C 12 על הממברנה למשך הלילה, ולמחרת, להרכיב את המהדקים על משטח המתיחה.

לאחר מכן, בסדרת ניסויים שנייה, רקמות אבי העורקים של בית החזה נדחות ממודל עכבר ומנקות מכל רקמות חיבור. ואז רקמת אבי העורקים מותקנת על פלטפורמת המתיחה באמצעות סט אחר של מהדקים. בסופו של דבר, פלטפורמת המתיחה משמשת לגרימת עיוות בתאים לאורך שני כיוונים אורתוגונליים הניתנים לכימות באמצעות מיקרוסקופ הפוך.

או לחילופין, מתמר כוח משולב במכשיר המתיחה כדי למדוד את נוקשות הרקמות. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני הטכניקות הקיימות, כגון מתיחת תאים חד פעמית או דו-צירית, הוא בכך שהיא מאפשרת לנו לשלוט באופן עצמאי על העיוות בשני כיוונים אורתוגונליים בקרום שקוף שעליו מחוברים תאים, ולכן מאפשרת הדמיית תאים חיים. מיקרוסקופיה גם עיצוב קפדני של סט מהדקים שונה.

עם שילוב של משתמש ארבע מיתרים בפלטפורמה, מאפשר לנו לבצע 10 בדיקות תאים על רקמה ביולוגית לצורך כימות התכונות המכניות שלהם. סרטון זה מציג את פלטפורמת המתיחה הדו-צירית, מכשיר שנבנה בהתאמה אישית שניתן להשתמש בו כדי לחקור את ההשפעה של עיוות מצע ברמה התאית, ולבצע בדיקות מתיחה על רקמות ביולוגיות. העיצוב והתכונות של פלטפורמת המתיחה הדו-צירית מפורטים בכתב היד הנלווה כדי לחקור את ההשפעה של עיוות מכני של תאים בודדים, תחילה יש לייצר מצע גמיש ושקוף שעליו תאים יכולים להיצמד

כדי להתחיל בהליך זה, פיפטה 500 מיקרוליטר של תמיסת מיקרוספרה פלואורסצנטית לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה ב-16, 200 גרם למשך 10 דקות, השליכו את הסופרנט והוסיפו 500 מיקרוליטר איזופרופנול, ולאחר מכן חמש דקות של מערבולת. הניחו את הבקבוקון בצד למשך הלילה בחושך על מנת לאפשר לכל אגרגט חלקיקים גדול לשקוע למחרת בבוקר, העבירו בזהירות את ה-SNAT לבקבוקון מיקרו צנטריפוגה נקי. ניתן להשתמש בתמיסת חרוזים זו לייצור יותר מחמישה מצעים מכיוון שתמיסת החרוזים תמשיך לשקוע בשלושת הימים הקרובים.

חשוב להימנע מ-Resus להשעות את הגלולה. יוצקים 0.5 גרם מחומר הריפוי המצורף לערכת PDMS לבקבוקון מיקרו צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר. הוסף 15 מיקרוליטר חרוזי פלורסנט ומערבולת למשך דקה אחת.

חזור על כך חמש פעמים נוספות כדי להוסיף בסך הכל 90 מיקרוליטר חרוזים מניחים בצד. שוקלים 10 גרם PDMS, מוסיפים 0.5 גרם מחומר הריפוי, בתוספת חרוזים פלואורסצנטיים ומערבבים לפחות 12 דקות. לאחר מכן, השתמש בפיפטת ההעברה כדי להעביר ארבעה מיליגרם של ה-PDMS עם חרוזים לתבנית בצורת צלב SUH 2050 שיוצרה בעבר בטכניקות פוטוליתוגרפיה סטנדרטיות.

התבנית בגובה של 320 מיקרומטר ושטח של 13.4 סנטימטרים רבועים ויכולה להכיל 428 מיקרוליטר או 440 מיליגרם PDMS לרפא את ה-PDMS למשך שעתיים ב-80 מעלות צלזיוס. לאחר ריפוי קילוף המצע מהתבנית, ניתן לשמור את המצע בצלחת פטרי בטמפרטורת החדר למשך שבועיים מבלי להראות שינויים משמעותיים ותכונותיו המכניות. יוצקים טיפות PDMS בצלחת פטרי בגודל סופי של כארבעה מילימטרים בקוטר, מרפאים אותן הפוכות במשך שעתיים בחום של 80 מעלות צלזיוס, יש לשמור על המנה הפוכה כדי למנוע מהטיפות להשתטח בתהליך הריפוי.

ניתן לשמור את תכונות העיגון הללו בצלחת פטרי במשך שבועות. פלזמת אוויר מטפלת במצע ובשמונה תכונות עיגון, קושרת את התכונות בכל קצה המצע במרחק של ארבעה מילימטרים מהשקע בצורת ריבוע הקיים על המצע כדי להרכיב את הממברנה על המהדקים. עטפו כל קצה של המצע סביב החלק הגלילי של החריץ של המהדקים, ואבטחו אותו במקומו עם שני הברגים שנקבעו מלמעלה.

הברג את ארבעת המהדקים על מחזיק המהדק. לאחר מכן שפכו PDMS בממשק שבין המצע לחלק המחורץ של המהדקים. מורחים את ה-PDMS הלא נרפא סביב החלק הגלילי המחורץ באמצעות מפתח משושה בגודל 1.5 מילימטר.

יוצקים PDMS בחריצים עד למילוי מלא על ידי פעולה נימית ומרפאים את המכלול ב-80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפני זריעת תאים על הממברנה. פלזמת אוויר. טפל בכל המכלול כדי לעקר ולתפקד את המצע כדי לאפשר ציפוי קולגן.

פונקציונליזציה של אזור המצע בו ייזרעו תאים עם מיליליטר אחד של 0.02 חומצה אצטית מולרית בתוספת 16 מיקרוגרם למיליליטר של קולגן זנב חולדה בטמפרטורת החדר למשך שעה. צפיפות הקולגן הסופית הרצויה היא חמישה מיקרוגרם לסנטימטרים רבועים לאחר שעה יש לשטוף את המצע שלוש פעמים עם מאגר פוספט ולתת לו להתייבש בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לפחות. הוסף 40 מיקרוליטר של מדיום תרבית, בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו -1% פניצילין.

סטרפטומיצין המכיל 2000 תאים בחלק המרכזי של המצע לכיסוי שטח של סנטימטר רבוע אחד. בדוגמה זו, צפיפות התאים היא 20 תאים לסנטימטרים רבועים. עם זאת, ניתן לשנות את צפיפות התאים בהתאם לדרישות הניסוי.

הכניסו את כל המכלול לחממת תרבית תאים רגילה כשהמצע פונה כלפי מעלה עם טיפת מדיום התרבות המכיל תאים עליו. יש לשמור על המכלול כשהמצע פונה כלפי מעלה למשך שלוש שעות לפחות כדי לאפשר לתאים להיצמד אליו היטב כדי למנוע אידוי. 30 מיקרוליטר של מדיום תרבית חם מתווספים לטיפה שעל המצע.

כל 45 דקות לאחר שלוש שעות, הפוך את כל המכלול לצלחת פטרי מלאה במדיום תרבית טרי כדי לטבול את המצע בדגירה למשך הלילה כדי לאפשר לתאים להתרבות למחרת. התקן את ההתקנה על ניגוד פאזה הפוך או מיקרוסקופ פלורסנט. התקן את מכלול מצע המהדק על פלטפורמת המתיחה הדו-צירית, והמנועים ממלאים את צלחת הפטרי בתוך מחמם צלחת הפטרי בתמיסת מלח חוצץ HEPs טרייה.

פתרון פיזיולוגי זה משמש לשמירה על התאים בשלב המיקרוסקופ על ידי חיקוי סביבת הדם הרגילה של הרקמות. ניתן להשתמש באותה פלטפורמת מתיחה דו-צירית גם כדי לכמת את הנוקשות של דגימות רקמה קטנות. אבי העורקים של עכבר מבודד ישמשו בהדגמה זו.

הסר את הסרעפת, כלוב בית החזה ואונות הריאה מהעכבר שעבר המתת חסד כדי למזער את הסיכון לפגיעה ברקמה. שמור על הלב מחובר לאבי העורקים והימנע מלגעת בכלי הדם ישירות אך במניפולציה. שימוש בלב.

הסר את הלב, שורש אבי העורקים ואבי העורקים החזי על ידי חיתוך עדין בין הכלי לעמוד השדרה כדי לשמור על המבנה הפנימי של הרקמה שלם. היזהר לא לגרום להתארכות כלשהי בכלי במהלך החתך. טבלו מיד ושמרו את הלב ואבי העורקים בתמיסת קרבס, המוכנה מדי יום ונשמרת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במהלך הניסויים.

חותכים ושוטפים בזהירות את אבי העורקים בתמיסת קרבס כדי להסיר קרישי דם הפועלים תחת מיקרוסקופ ניתוח כירורגי. הסר רקמת חיבור באמצעות מספריים ופינצטה. חשוב לשמור על כל אורך הכלי ולהשתמש בשורש אבי העורקים כדי לקבוע את כיוון הכלי.

מידות הכלי הפרוק נדרשות כדי לקבוע את קשיחות הכלי. חותכים טבעת אבי העורקים באורך של כשני מילימטרים ומודדים במדויק את אורכה באמצעות הגדרת מיקרוסקופ מכויל. שים את הקטע הזה בצד בפתרון של קרב.

לאחר מכן, חותכים שתי טבעות אבי העורקים הקטנות מקטעי אבי העורקים שנותרו לאחר הסרת הקטע של שני המילימטרים. טבעת אחת מקטע אבי העורקים לפני קטע שני המילימטרים, וטבעת נוספת מקטע אבי העורקים. לאחר קטע שני המילימטרים, הניחו את שתי טבעות אבי העורקים על שקופית זכוכית מיקרוסקופ כשהלומן פונה כלפי מעלה ומדדו את עובי הדופן באמצעות הגדרת מיקרוסקופ מכויל.

עובי דופן אבי העורקים נמדד ומחושב בממוצע באמצעות שתי טבעות אלה. מלאו את צלחת הפטרי על משטח המתיחה הדו-צירי בתמיסת קרבס והכנסו את קטע טבעת אבי העורקים בשני מילימטר על סיכות המשיכה. בפרוטוקול זה, פלטפורמת המתיחה הדו-צירית שימשה לחקירת התגובה המכנית של הגרעין בתאי מיובלסט של עכבר בודד שנחשפו לעיוות מצע של 25% דפורמציה תזוזה.

קשרים מביצוע מתיחות חד-ציריות סטנדרטיות וטהורות מוצגים בתוצאות מייצגות אלה. חרוזי פלורסנט נבחרים ידנית בפריים הראשון של הסרטון ועוקבים אחריהם מפריים אחד לשני עד שמגיעים למתיחה מקסימלית לאורך הכיוונים האופקיים והאנכיים. סקריפט MATLAB מחשב אוטומטית את רכיבי טנזור המתח הירוק עבור כל מסגרת, ומייצר עקומת כיול של המתח ביחס לתזוזה של המנוע.

בגרפים אלה, הקווים הכחולים והאדומים תואמים את מרכיב ההיר המתוח הירוק לאורך הכיוונים האופקיים והאנכיים בהתאמה. תוצאות אלו ממחישות את היכולות של פלטפורמת המתיחה הדו-צירית לגרום לעיוות במצע לאורך שני כיוונים אורתוגונליים. בנוסף לחד-צירי סטנדרטי של שדות מתח דו-ציריים EQU, פלטפורמת המתיחה הדו-צירית יכולה לגרום לשדות מתח מורכבים במצע.

פאנל G מראה שמתיחה של אותו מצע בארבעה מילימטרים לאורך ציר ה-x ומתיחה קלה לאורך ציר ה-Y ב-1.5 מילימטרים המודגשים באדום, מייצרת שדה חד-צירי טהור ללא עיוות דחיסה במצע. פאנל, H מראה כי מתיחת המצע לאורך ציר ה-x ב-3.5 מילימטרים מייצרת עיוות של 25% ועיוות דחיסה של 7% כאשר קצות המצע לאורך הציר האנכי קבועים, מודגשים באדום עם היכולת לבצע הדמיית מיקרוסקופיה של תאים חיים במהלך מתיחת הגרעינים נצבעו בצבע פלואורסצנטי של תא חי הקושר את ה-DNA ולאחר מכן נמתח ב-25% לאורך כל ציר מתיחה אורתוגונלי כ מומחשים כאן בין כל שלב מחזור מתיחה, נרכשו תמונות ניגודיות ותמונות פלואורסצנטיות של הגרעין הלא מעוצב והמעוות. אורכי הציר הגרעיני הראשי והמינורי לאורך המצב הלא מעוצב וכאשר הגרעין נמתח ברצף לאורך הציר הראשי והמינורי שלו נקבעו באמצעות תוסף תמונה J ושימשו לחישוב השינוי היחסי באורך.

לאורך כל ציר בגרף עמודות זה, הציר X או הציר הראשי מוצג בכחול, והציר y או הציר הקטן מוצג באדום. יכולת העיוות של הגרעין מציגה אניזוטרופיה מכנית מכיוון שהיא מציגה יכולת עיוות גבוהה משמעותית לאורך הציר הקטן שלה, בהשוואה לציר הראשי שלה, תפקיד השלד הציטולוגי של האקטין והמיקרו-צינורות בוויסות יכולת העיוות הגרעיני נבדק על ידי דה-פולימריזציה, חוטי האקטין או המיקרו-צינורות באופן סלקטיבי באמצעות ציטו D ו-neol בהתאמה דה-פולימריזציה. חוטי האקטין או המיקרו-צינורות נמצאו כגורמים לאובדן יכולת הצורה האנאיזוטרופית של הגרעין.

תוצאות אלו תומכות בממצאים כי רכיבי שלד תאים מעבירים כוחות לגרעין מהמצע והם חיוניים גם לשימור ההתנהגות המכנית הטבעית של הגרעין. במהלך דפורמציה, פלטפורמת המתיחה הדו-צירית שימשה גם להערכת ההשפעה של ביטוי יתר כרוני של חלבון הלם חום 27 או HP 27 על נוקשות כלי הדם HSP יתר על ביטוי. במודל עכברים הנוטה לטרשת עורקים, שלילי הומוזיגוט POE משנה את ההרכב ההיסטולוגי של נגעי טרשת עורקים על ידי הגדלת תאי השריר החלק האינטימיים ותכולת הקולגן.

כדי לקבוע את ההשפעה של שיפוץ היסטולוגי זה על התכונות המכניות של כלי הדם, נעשה שימוש בפלטפורמת המתיחה למדידת קשיחות אבי העורקים. גרף זה מציג עקומת מתח מתח טיפוסית המתקבלת ממתיחת כלי אבי העורקים בעוד שהקשיחות מחושבת ב-30% מהמתח. הנוקשות היא שיפוע המשיק המצוין על ידי הקו האדום לעקומה.

נמצא כי הנוקשות של מקטעי אבי העורקים של HSP 27 על פני עכברים מבטאים גדלה משמעותית ב-41% בהשוואה למודל עכבר הביקורת. יחד ההערכה המכנית בשילוב עם היסטולוגיה של כלי הדם והפלאק הראתה כי ביטוי יתר של HSP 27 מאופיין בנוקשות מוגברת של כלי הדם ותכולת תאי השריר החלק של קולגן. תוצאות אלה מצביעות על כך ש-HSP 27 עשוי להגביר את היציבות של נגעים טרשת עורקים ולכן להפחית את הסיכון לקרע בפלאק לאחר התפתחותו.

טכניקה זו משלמת דרך חדשה לחוקרים בתחום הביו-הנדסה לחקור את תגובת התאים לעיוות מכני מורכב ואינוטרופי ליישומים בביולוגיה מכנית, אך גם לנטר מכניקת רקמות ביולוגיות במחלות.