גלוטמין שטף הדמיה באמצעות חיישני מקודדים גנטיים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמות הובלת גלוטמין באמצעות טרנספורטר ביטוי הטרולוגי בתאים חיים באמצעות העברת אנרגיית תהודה ראשונה או חיישני סריגים. זה מושג על ידי טרנסקטציה ראשונה של שבעה תאים עם חיישן גלוטמין וטרנספורטר. החיישן מורכב מתורם פריט המוחדר לחלבון קושר גלוטמין חיידקי ומקבל שריג בקצה C של חלבון קושר הגלוטמין.

השלב השני הוא הקמת מערכת זלוף והדמיית התאים בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. השלב האחרון הוא לנתח את התמונות ולהמחיש את דינמיקת הגלוטמין. בסופו של דבר, ניתן לזהות פעילויות טרנספורטר בתא בודד באמצעות חיישני השריגים הללו.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מדידה מבוססת כרומטוגרפיה, הוא שאתה מקבל רזולוציה זמנית מרחבית גבוהה בהרבה. טכניקה זו מורכבת משלושה חלקים, טרנספקציה של תאים עם חלבוני חיישן, הדמיה בזמן אמת ועלות ניתוח לאחר ניסוי. שבעה תאים משמשים בניסוי זה בשל פעילות הובלת הגלוטמין האנדוגנית הנמוכה שלהם.

זרע את התאים בכ-70 עד 80% שטף משותף ב-DMEM בתוספת 10% סרום עגל קוסמי או CCS ו-100 יחידות למיליליטר. סטרפטומיצין פניצילין בכלי תחתית זכוכית שמונה בארות. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, 100% לחות למשך 24 שעות.

אחרי 24 שעות. החלף את מצע הגידול ב-DMEM בתוספת 10% CCS ללא אנטיביוטיקה גדל בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 100% לחות ביום הטרנספקציה. הוסף 0.4 מיקרוגרם כל אחד מה-DNA של הפלזמה המקודד את חיישן הגלוטמין ואת מחליף חומצות האמינו החובה המתויג m cherry A SCT שניים עד 50 מיקרוליטר של מדיה חופשית בסרום.

הוסף מיקרוליטר אחד של מגיב טרנספקציה ל-50 מיקרוליטר של מדיה ללא סרום, מערבבים בעדינות ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, מערבבים את התמיסה המכילה את ה- DNA עם מגיב הטרנספקציה המדולל ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לאחר 20 דקות, מוסיפים בעדינות את תערובת המגיב הטרנספקציה על גבי שבעת התאים העולים ומערבבים בעדינות על ידי נדנוד החדר.

דגירה למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו-100% לחות לאחר 24 שעות. החלף את המדיום ב-DMEM בתוספת 10% CCS בתוספת 100 יחידות של סטרפטומיצין פניצילין. החזר את התאים לאינקובטור לפני תחילת הזלוף.

הכן מאגרי זלוף A עד F בהתאם למתכונים בכתב היד הנלווה. חבר את קוקס העצירה למזרקים של 50 מיליליטר. סגור את העצירה ומלא את המזרקים בתמיסות הזילוף.

פתח את זין העצירה לפרק זמן קצר כדי למלא את חלל הראש בזין העצירה עם המאגר. לאחר מכן, הפעל את כוח המשיכה של שמונת הערוצים. הזינו מערכת זלוף עם עיפרון זלוף ובחרו מצב ידני.

תחת אפשרות בחירת הפונקציה. הניחו מיכל פסולת מתחת לעיפרון הזלוף. להצלחת ניסוי זה, חשוב להגדיר את הזלוף באופן שממזער את הסחיפה ואת העברת התמיסה.

הפעל ידנית את היציאות על ידי לחיצה על המספרים המתאימים ומלא את הצינורות במים. בעזרת מזרק של 10 מיליליטר, סגור את היציאות, הגדר את המזרקים המכילים מאגרים A עד F ביציאות 1 עד 6 של מערכת הזילוף, ופתח את העצירה. לאחר מכן.

פתח שוב את היציאות כדי להחליף את המים בצינור עם המאגרים. קצב הזרימה צריך להיות בסביבות 0.8 מיליליטר לדקה. לחצו על ביטול פעם אחת בבקר הזילוף כדי לחזור לתפריט בחירת הפונקציות.

עבור לאפשרות עריכת התוכנית ולאחר מכן הקלד את פרוטוקול הזלוף המצוין בטבלה זו. שמור את תוכנית הזילוף. התאים מצולמים 48 עד 72 שעות לאחר הטרנספקציה.

שטפו את הבארות של כלי הזכוכית התחתון פעמיים עם מאגר זלוף A תוך הקפדה לא לשטוף את התאים. הנח את צלחת הזכוכית התחתונה על הבמה של המיקרוסקופ הפלורסנט. חבר את מערכת הזלוף לתא.

אם משתמשים בתא פתוח, הגדר משאבה נוספת המוציאה את תמיסת הזלוף מהתא. פתח את תוכנת ההדמיה של חוברות השקופיות. התחל שקופית חדשה באמצעות פונקציית המיקוד, מצא תאים המבטאים את החיישן ודובדבן SCT שני M באמצעות ערכות סינון מתאימות.

כוונן את הרווח על ידי לחיצה על לשונית המצלמה והחלקת סרגל ההחלקה תחת רווח. כמו כן, התאם את הגדרת מסנן הצפיפות הנייטרלית מהתפריט הנפתח של מסנן הצפיפות הנייטרלית. לחץ על לכידת תמונה ולאחר מכן, בחלון הרכישה, ציין את המסננים שבהם יש להשתמש.

התמונות יירכשו בשלושה ערוצים. עירור תורם, עירור תורם פליטת תורם, משימת קבלה ומשימת קבלת עירור מקבל. לחץ על כפתור הבדיקה כדי להתאים את זמן החשיפה על ידי הקלדת זמן החשיפה הרצוי בתיבה לצד הגדרות המסנן, יש לחשוף את כל שלושת הערוצים לאותו פרק זמן.

ציירו אזור עניין בעזרת הכלי אזורים. בחר קיטועי זמן בתיבה סוג לכידה. לאחר מכן ציין את המרווח ונקודות הזמן עבור הניסוי.

לאחר מכן, ציירו אזור באזור ללא תאים פלואורסצנטיים שישמשו לחיסור רקע. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על האזור שצויר ולאחר מכן הגדר אותו כרקע. באופן אידיאלי, תאים שאינם מבטאים את החיישנים צריכים לשמש כאזור הרקע כדי להסביר הן את האוטופלואורסצנטיות והן את הקרינה ברקע שזוהו על ידי המצלמה.

בחר את התוכנית הרצויה תחת בחר אפשרות להריץ פונקציות, עבור לתוכנית השמורה ולאחר מכן לחץ על Enter בבקר הזילוף. התוכנית נטענת כעת ולחיצה על מקש כלשהו תתחיל את הזלוף כדי להבטיח שגם הזלוף וגם ניסוי ההדמיה יתחילו בו זמנית. לחץ על כפתור ההתחלה בחלון הלכידה במקביל ללחיצה על מקש בבקר הזילוף.

מוצגים כאן ניסויים טיפוסיים של מהלך זמן המשתמשים בתאים coex המבטאים את חיישני הגלוטמין a s CT two transporter ו-fret עם זיקה של שמונה מילימולר ו-100 מיקרומולר. זרם גלוטמין מזוהה כשינוי ביחסי עוצמת הקרינה בין mtfp התורם לוונוס המקבלת. זרם גלוטמין בנוכחות אלנין מוכח גם הוא במצע.

ניתן לבחון את הספציפיות של הטרנספורטרים גם באמצעות החיישנים. כאן, התאים הוטענו מראש בגלוטמין ולאחר מכן נוספו חומצות אמינו שונות לתוסף החוץ-תאי. שמונה כצפוי A ct שני סובסטרטים גרמו לגלוטמין flx, בעוד שחומצות אמינו שאינן סובסטרט לא.

היעדר שינויים ביעילות השריג עם הוספת מצע יכול לנבוע מכמה סיבות, כגון יכולת הספיגה הנמוכה של המצע הנבדק כפי שמוצג בתאים המבטאים את חיישן שמונה המילימולרים או את חיישן 100 המיקרו-מולרי. אבל זה לא מבטא את הטרנספורטר a s CT two כדי לאשר ששינוי יעילות השריג נובע מהשינוי בפועל במצע ולא מהשינוי בפרמטרים אחרים. אותו פרוטוקול זלוף מבוצע באמצעות תאים המבטאים חיישן שצפוי להיות רווי בתנאי הניסוי.

והדוגמה הזו, הזיקה של החיישן היא 1.5 מיקרומולר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לדמות את הדינמיקה של מטבוליטים באמצעות חיישני פריט. אל תשכח שיש לטפל בתרבית תאים כראוי בהתאם לנהלי ההפעלה הסטנדרטיים כך שהסיכון לחשיפה ממוזער.