פונקצית phenotyping עכבר ריאתי In vivo עם קיבולת הריאות לשדר
6 בינואר 2015
אנו מתארים אמצעי למדידה מהירה ופשוטה של יכולת פיזור הריאות בעכברים ומראים שהוא רגיש מספיק לשינויים פנוטיפיים בפתולוגיות ריאה נפוצות מרובות. מדד זה מביא אפוא רלוונטיות תרגומית ישירה למודלים של העכברים, מכיוון שיכולת פיזור נמדדת בקלות גם בבני אדם.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא ללמוד כיצד למדוד את יכולת הפיזור של הריאות של עכבר באמצעות כרומטוגרף גז מכויל. זה מושג על ידי ניפוח הריאות של עכבר מורדם בגז המכיל ניאון ופחמן חד חמצני, החזקת הגז בריאות למשך תשע שניות ואיסוף הגז. הגז שנשאב מהריאות מדולל לאחר מכן לשני מיליליטר ומוזרק לכרומטוגרף הגז.
הספיגה הדיפרנציאלית של ניאון ופחמן חד חמצני בריאה משמשת לחישוב יכולת הפיזור. ניתן להשתמש במדידה זו כדי להעריך את אובדן תפקוד הריאות בספקטרום רחב של מודלים של מחלות ריאה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני כל השיטות הקיימות האחרות למדידת תפקוד ריאתי בעכבר הוא שמדובר במדידה פשוטה מאוד הניתנת לשחזור שניתן להשוות ישירות למדידות דומות בבני אדם.
ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לעקוב אחר השינויים במבנה הריאות המתרחשים במגוון פתולוגיות ריאה. פרוטוקול זה מתחיל בהגדרת מודול כרומטוגרף הגז המסופק עם המכונה למדידת שיאים עבור חנקן, חמצן, ניאון ופחמן חד חמצני. עבור יישום זה, יש צורך רק בנתוני הניאון והפחמן החד-חמצני.
המכשיר משתמש בעמוד מסננת מולקולרית עם הליום כגז הנושא. לכרומטוגרף הגז הספציפי הזה יש עמודה של 0.8 מיליליטר ודגימה של שני מיליליטר משמשת כדי להבטיח פינוי נאות של עמודה זו לפני שמתחילים. סדרה של מדידות תמיד מכיילת את המכונה באמצעות שני מיליליטר גז ישירות משקית דגימת הגז.
השיא הראשון שמופיע הוא הניאון, ואז חמצן וחנקן, שאיננו מודדים עבור הליך זה. לבסוף, שיא הפחמן החד-חמצני מופיע בזמן לכרומטוגרף הגז. למדוד את כל הפסגות הללו זה קצת פחות מדקה אחת.
כדי להתחיל, יש להרדים את העכברים עם קטמין וקסילזין. אשר את ההרדמה על ידי היעדר תנועת רפלקס בתגובה לצביטה בבוהן. לאחר מכן, כדי להגן על העיניים, יש למרוח משחה וטרינרית, ואז טרכאוסטומיה של העכברים בעזרת צינורית סטודן.
השתמש בצינורית 18 למבוגרים או בצינורית 20 לעכברים צעירים מאוד. לאחר מכן, הפעל את המטרונום עם לחיצות נשמעות כל שנייה. עבור עכברים מעל שישה שבועות, השתמש במזרק של שלושה מיליליטר כדי להוציא 0.8 מיליליטר גז משקית תערובת הגז.
אם העכבר בן פחות מארבעה שבועות, השתמש ב 0.4 מיליליטר גז, ואז חבר את המזרק לצינורית קנה הנשימה ונפח במהירות את הריאות. התחל לספור מנטלית מ-1 עד 10 בסנכרון עם לחיצות המטרונום. כאשר הספירה מגיעה ל -10, משוך במהירות את הנפח של 0.8 מיליליטר.
לדלל את הגז הננשף הזה לשני מיליליטר על ידי הוספת מקום, אוויר ומשקל לפחות 15 שניות. חשוב מאוד לנפח ולרוקן את הריאות במהירות האפשרית. ניפוח מהיר הוא קל מאוד, אך נדרש מעט תרגול כדי למשוך במדויק את ה-0.8 מ"ל במהירות, ואז להזריק את כל הדגימה לתוך כרומטוגרף הגז.
לצורך ניתוח, חשוב להימנע מזיהום של הדגימה בעת העברה אל החיה וממנה ואל כרומטוגרף הגז. ניתן לעשות זאת בזהירות על ידי כיסוי השלט באצבע בזמן שה-GC מודד את הדגימה. נפחו את ריאת העכבר בעוד 0.8 מיליליטר של תערובת גז מהשקית, ולאחר מכן עבדו את הדגימה הזו באופן זהה לראשונה.
בעזרת הערכים הממוצעים משתי המדידות, חשב את ה-DFCO. הכתב התחתון C מתייחס לגזי הכיול, והתשעת מתייחס לדגימות שנאספו מהחיה. אחרי עצירת נשימה של תשע שניות.
ערך DFCO בקרה נומינלי שנלקח משישה עכברים שחורים C 57 הוא כ-0.77. במחקר שהשתמש במודל שפעת PR 8, אובדן תפקוד מתקדם נצפה ביום השישי והשמיני במודל של אמפיזמה 21 יום לאחר התקנת אלסטזות. ה-DFCO ירד במידה מתונה, אך היו שינויים גדולים בהרבה במודל הפיברוזיס שנגרם על ידי התקנת Blio Mycin.
המסלול הפיברוטי שנגרם על ידי בלאומיצין הביא לשינוי הגדול ביותר ב-DFCO שנצפה בכל אחד מהמודלים הפתולוגיים. זה חשוב מכיוון שיכולת הפיזור היא גם סמן אמין לפיברוזיס בבני אדם. הגן CFTR ממלא תפקיד מכריע בסיסטיק פיברוזיס ובמחקר על עכברים חסרי גן זה, חלה ירידה משמעותית ב-DFCO.
ה-DFCO ירד עוד יותר עם זיהום פטרייתי בעכברי נוקאאוט אלה. מודל נפוץ לפגיעה ריאתית נגרם על ידי LPS. בעכברים שנחשפו ל-LPS, היה אובדן מתקדם תלוי זמן של תפקוד הריאות מהיום הראשון עד הרביעי כפי שהוערך על ידי מדידות DFCO, מדידת DFCO יכולה להתבצע בהצלחה בעכברים החל מגיל שבועיים.
הגודל הקטן יותר של הריאה דורש נפח ניפוח קטן יותר של 0.4 מיליליטר. ה-DFCO שנמדד בנפח קטן יותר זה מסוגל להראות את העלייה הצפויה ככל שהריאה מתבגרת לאחר שליטה. טכניקה זו יכולה להיעשות תוך דקות ספורות לכל עכבר לפני ביצוע מדידות או הערכות אחרות של תפקודי הריאות.
בזמן ניסיון הליך זה חשוב להקפיד לבצע את שלב הניפוח והדפלציה במהירות ולהקפיד על העברת הדגימה כדי למנוע זיהום.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה למדידת קיבולת הדיפוזיה של הריאות בעכברים באמצעות כרומטוגרף גז מכויל. הטכניקה רגישה לשינויים בפנוטיפ במגוון פתולוגיות של הריאה, דבר ההופך אותה לרלוונטית למחקר תרגומי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- פיזיולוגיה של מערכת הנשימה
- מחקר טרנסלציונלי
רקע
- קיבולת הדיפוזיה של הריאות היא מדד קריטי לתפקוד ריאתי.
- שיטות קיימות למדידת תפקודי ריאה בעכברים עשויות להיות מורכבות.
- מחקרים השוואתיים בין עכברים לבני אדם חיוניים לרלוונטיות תרגומית.
- דרושות טכניקות פשוטות וניתנות לשחזור לצורך מחקר יעיל.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה פשוטה למדידת קיבולת הדיפוזיה של הריאות בעכברים.
- הערכת אובדן תפקוד ריאתי במגוון מודלים של מחלות ריאה.
- קידום השוואות של מדידות תפקוד ריאתי בין עכברים לבני אדם.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ניפוח של ריאות עכבר תחת הרדמה באמצעות תערובת גזים המכילה נאון ופחמן חד-חמצני.
- החזקת הגז בריאות למשך תשע שניות לפני האיסוף.
- דילול של הגז שנאסף לשני מיליליטרים לצורך אנליזה.
- שימוש בכרומטוגרף גזים למדידת ספיגה דיפרנציאלית של גזים.
תוצאות עיקריות
- השיטה מספקת מדידה מהימנה של קיבולת הדיפוזיה של הריאות.
- היא רגישה לשינויים בתפקוד הריאות הקשורים לפתולוגיות שונות.
- הטכניקה פשוטה וניתנת לשחזור, דבר המשפר את ישימותה במחקר.
- ניתן להשוות את התוצאות באופן ישיר למדידות דומות בבני אדם.
מסקנות
- שיטה זו מציעה כלי בעל ערך להערכת תפקודי ריאה במודלים של עכברים.
- היא תומכת במחקר תרגומי על ידי גישור בין מדידות בעכברים לבני אדם.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בטכניקה זו כדי לחקור פתולוגיות של הריאה בצורה יעילה יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מדידת קיבולת הדיפוזיה של הריאות בעכברים מספקת בדיקת תפקוד ריאתי תרגומית המאפשרת השוואה ישירה לנתונים קליניים בבני אדם. גישה זו תומכת באפיון פנוטיפי של מודלים למחלות ריאה ומגבירה את הביטחון החזוי בתיקוף של מטרות פרה-קליניות. פשטותה והריפרודוקביליות של השיטה מקלות על שילובה בתהליכי גילוי לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים ומיון פורטפוליו.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות כימות של אובדן תפקוד ריאות במודלים של נפיחות ריאתית (emphysema), פיברוזיס, פגיעה ריאתית חריפה וזיהום.
- ערך תפעולי: מספק בדיקה מהירה וניתנת לשחזור לצורך תיקוף תפקודי של מטרות טיפוליות במחקרי פתולוגיה של ריאה בעכברים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מספק קריאות כמותיות המבוססות על חילוף גזים, המתאימות לסריקת השפעות של תרכובות על מבנה הריאה ותפקודה.
- ערך תפעולי: הליך סטנדרטי עם קריאה של פחות מ-1 דקה התומך בסריקה פנוטיפית בעלת תפוקה גבוהה בקווי תגליות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תואם למדידות קיבולת דיפוזיה אנושית, מה שמאפשר התאמה של סמנים ביולוגיים בין מינים ורציפות תרגומית.
- ערך תפעולי: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי זיהוי שינויים תפקודיים מוקדמים במודלים פרה-קליניים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מטרה דרך זיהוי מוביל ועד לבדיקת יעילות פרה-קלינית, ובכך היא מהווה גשר פנוטיפי בין מודלים עכבריים לבין נקודות סיום קליניות בבני אדם.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי זיהוי שינויים מבניים בריאה באמצעות מדדי חילוף גזים תפקודיים.
- סקר: מאפשר מוכנות של בדיקות באמצעות איסוף גזים סטנדרטי וניתוח כרומטוגרפי של ספיגת נאון ופחמן חד-חמצני.
- אנליטיקה: מייצר ערכים כמותיים של קיבולת דיפוזיה (DFCO) המאפשרים השוואה של תפקוד הריאות בין תנאים ניסויים ונקודות זמן שונות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין פנוטיפים של עכברים לרלוונטיות קלינית אנושית באמצעות השוואה ישירה של מדידות קיבולת דיפוזיה.
- שימוש חוזר ארגוני: מייצג יכולת רב-פעמית לניטור אורך של תפקוד הריאות במגוון מודלים של מחלות ובשלבי מחקר שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במודלים של פתולוגיה של הריאה באמצעות פנוטיפוינג כמותי.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות זרימת עבודה מהירה של הזרקת גז, עיכוב נשימה ואנליזת GC.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go באמצעות אספקת מדדים תפקודיים מוקדמים ורלוונטיים טרנסלציונלית המפחיתים סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מבוסס סיכון של תרכובות בהתבסס על שימור או שיפור תפקוד הריאה במודלים של מחלות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהרדמה של עכברים, קניולציה של הקנה וטכניקות לטיפול בגזים.
- תלוי בגישה לכרומטוגרף גזים מכויל עם עמודת נפה מולקולרית וגז נשא הליום.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של נפחי הגז, תזמון הניפוח ופרוטוקולים לדילול דגימות.
- כולל שיקולי התאמה עבור עכברים ניאונטליים לעומת עכברים בוגרים בשל גודל הריאות ונפחי הגז הנדרשים (0.4 mL לעומת 0.8 mL).
- כולל מגבלות מעשיות כגון הצורך למנוע זיהום של הדגימה במהלך ההעברה וחשיבותם של ניפוח וריקון מהירים של הריאות לצורך מדידות מדויקות.
