מולקולרי הבדיקה אופטימיזציה לקביעת תמותת תא באורגניזם פוטוסינתזה ( Aeruginosa Microcystis) שימוש cytometry הזרימה
29 בינואר 2016
אוכלוסיות חיידקים מכילות ההטרוגניות תא משמעותית, אשר יכול להכתיב התנהגות כוללת. ניתוח בדיקה מולקולרי באמצעות cytometry זרימה יכול לקבוע מדינות פיסיולוגיות של תאים, עם זאת היישום שלה משתנה בין מינים. מחקר זה מספק פרוטוקול לקבוע תמותת תאים בתוך אוכלוסיית cyanobacterium במדויק, בלי להמעיט או הקלטת תוצאות חיוביות שגויות.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים כיצד ליצור פרוטוקול שיכול לנתח את המצב הפיזיולוגי הציאנובקטריאלי ביעילות, באמצעות ציטומטריית זרימה ובדיקות מולקולריות. פרוטוקול זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי הפיזיולוגיה של התא של קהילות מיקרוביאליות. היתרון העיקרי בהליך זה הוא שפרוטוקול בדיקה פלואורסצנטי אופטימלי יכול להבחין בין המצבים הפיזיולוגיים של ציאנובקטריה ברמת התא הבודד בזמן אמת.
מי שידגים את ההליך הזה יהיה דיוויד הארטנל, דוקטורנט שעובד במעבדת הציטומטריה באוניברסיטת בורנמות'. לפני תחילת הניסוי, הנח צינור המוליזה ריק על בדיקת הזרקת הדגימה. לחץ על פתיחת סתימה.
ואז שטוף בחזרה כדי להתחיל בתהליך ניקוי ציטומטריית הזרימה. בסוף השטיפה האחורית, טען צינור המוליזה חדש המכיל שני מיליליטר מים מסוננים טהורים במיוחד על בדיקת הזרקת הדגימה, או SIP, והגדר את מגבלת הזמן ל-10 עד 15 דקות, ואת מהירות הנוזל למהיר. לאחר מכן, בחר תא נתונים חדש, והגדר את סף הקרינה ופיזור האור הרלוונטיים כדי להפחית את רעשי הרקע.
לאחר מכן לחץ על הפעל. אם סך האירועים בשנייה אינו נופל מהמלצת היצרן, הפעל שני מיליליטר של תמיסת טיהור למשך שתי דקות במהירות. וחזור על שלבי ההדחה האחורית ושטיפת מים טהורים במיוחד.
להכנת מונוקולטורה ראשונית של M.aeruginosa, חיטוי 98 מיליליטר מים מסוננים טהורים במיוחד, מעורבבים עם שני מיליליטר מדיום אצות, בכוס של 250 מיליליטר למשך 20 דקות בטמפרטורה של 120 מעלות צלזיוס. כאשר תרבית נמצאת בצפיפות מצב יציב גבוהה, פרק שני מיליליטר תאים על ידי מערבולת. ואז להעביר את התאים מתחת לבדיקת הזרקת הדגימה.
ודא שהתאים מפוזרים באופן שווה על ידי מיקרוסקופ אור. לאחר מכן בחר עלילת היסטוגרמה בתוכנת ציטומטר הזרימה כדי להקליט את נתוני פיזור האור קדימה. ולחץ על יומן כדי להציג את הנתונים בסולם יומן על ציר ה-x.
בפלט נפרד, הגדר היסטוגרמה נוספת של ציר לוג כדי לתעד את הקרינה הטבעית של תאי M.aeruginosa. לאחר מכן, בחרו מקור אור שיכול לעורר פיקוציאנין, וגלאי שיכול לסנן את הפליטות מהפלואורסצנטיות שנוצרה. להקלטה ברזולוציה הגבוהה ביותר, בחר את ההגדרות הקרובות ביותר לגודל הליבה של אורגניזם המטרה.
והגדר קצב זרימה איטי יחסית. לפני רכישת הנתונים, הגדר סף לשער כל פיזור אור ואותות פלואורסצנטיים הנגרמים על ידי רעשי רקע אלקטרוניים או פסולת דגימת תא. לאחר מכן בחר תא נתונים חדש.
צור תרשים צפיפות עם פרמטרים של פיזור קדימה וצדדית בקנה מידה של יומן, ולחץ על הפעל. כעת החל את פיזור האור קדימה ושער הקרינה הטבעי על נתוני הפיזור קדימה זה לצד זה כדי לא לכלול אותות פיזור ברמה נמוכה, ולכלול רק את אותות הפיקוציאנין הקרינה היחסית הגבוהים יותר. לאחר מכן אסוף אירועים עד לסיום הדגימה, והשתמש בנתונים כדי לקבוע את ספירת התאים הראשונית.
כדי לייעל את ספיגת תאי הבדיקה המולקולרית, חשוף מחצית מהמונוקולטורה שהוכנה בעבר לתנאים המתאימים ליצירת בקרה מתה. בדוק את הווריאציות בסביבת המיקרו של הדגימה כדי לאשר את מותה של התרבית. ואז לפרק את היווצרות המושבה כפי שהודגם זה עתה.
לאחר מכן, בחר לייזר של 488 ננומטר לצד גלאי שיכול לתעד פלואורסצנטיות מבדיקות חומצות הגרעין הירוקות והכתומות. והלייזר של 640 ננומטר כדי להקליט את אותות הפיקוציאנין דרך הגלאים שלהם. בגיליון נתונים חדש, הגדר תרשים צפיפות עם פרמטרים של פיזור קדימה וצדדית.
לאחר מכן צור היסטוגרמה אחת באמצעות ערוץ הגלאי האופטי של הגשושית המולקולרית המתאימה. היסטוגרמה אחת לזיהוי פליטות פיקוציאנין, והיסטוגרמה אחת לאירועי פיזור קדימה, הכל בסולם לוג. הפעל את הדגימות הציאנובקטריאליות באמצעות ריכוזים וזמני דגירה שונים.
צור שער בהיסטוגרמה של פיזור קדימה כדי לכלול אירועים רק עם גודל התא של אורגניזם המטרה. והחל אותו על תעלת בדיקת הקרינה המתאימה. לאחר מכן, בערוץ בדיקת הקרינה, צור שער תוכנה כולל נוסף כנגד השיא הגבוה ביותר בהיסטוגרמה.
ולאחר מכן שער את הקרינה החיובית המתאימה לעלילת הצפיפות. השווה את מספר אותות הקרינה למספר תאי הבקרה המתים, שבהם האחוז הגבוה ביותר של קליטת גרעין התא אינו מייצר צביעה לא ספציפית. לבדיקת חפיפת הפרעות הקרינה מצביעה פנימית או לא ספציפית של תאים, בחר את נתוני התרבית המעורבת של 50 אחוז חיים ו-50 אחוז מתים.
והסר את שערי הפלורסנט. החל שערים כדי לכלול רק את היסטוגרמה של פיזור קדימה עבור גודל התא של אורגניזם המטרה בהיסטוגרמה של ערוץ פיקוציאנין. שער הפסגות הגבוהות והנמוכות ביותר של פיקוציאנין, ותייג אותן חיות ומתות, בהתאמה.
לאחר מכן החל בנפרד את השערים על אותות פיקוציאנין חיים ומתים. ורשום את שני אורכי הגל הממוצעים. כדי לקבוע את רגישות הפרוטוקול, יחסו בין אורכי הגל הממוצעים של הקרינה המולקולרית החיובית של הגשושית המתה, לבין האות החי הלא ספציפי הפנימי.
לבסוף, בחר את הפרוטוקול האופטימלי שבו הכמות הגבוהה ביותר של תאים מתים הוכתמה ללא התרחשות של צביעה לא ספציפית. בגרפים אלה מוצגים יציאות פיזור האור המייצגות קדימה וצדדית, עבור גודל התא והמורכבות הפנימית של תרבית אצווה M.aeruginosa בשלב האקספוננציאלי. ניתן לבצע שער על ידי זיקוק הנתונים בין נקודות מסוימות של תפוקת פיזור האור קדימה.
פיקוציאנין מייצר אות חזק כאשר הוא נחקר על ידי מקור אור אדום, שיכול לשמש כדי להגביר את האוכלוסיות המעניינות. מפיזור האור הקדמי והאותות הפלואורסצנטיים, ניתן לסגור נתונים מהפלט המקורי, לנתונים ספציפיים על דגימת M.aeruginosa לספירת תאים סופית. כאשר מערבבים בקרות חיות בעלות פיגמנט גבוה יותר ופיגמנט נמוך יותר, השינוי ההולך ופוחת בפלואורסצנטיות האוטומטית מתבהר.
בתאים שנפגעו על ידי הממברנה, בדיקות חומצות הגרעין מייצרות אות נוסף שניתן לצפות בו על ידי ציטומטריית זרימה ולאשר עוד יותר על ידי מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. הבחנה פלואורסצנטית בין תאים חיים ומתים עולה עם הזמן בין ריכוזי המיקרו-מולרים של 0.05 ל-0.5, אך יורדת בין ריכוז אחד ל-100 מיקרו-מולרי עבור שני הבדיקות. ואכן, נראה כי הריכוז האופטימלי עבור בדיקת חומצת הגרעין הירוקה הוא 0.5 מיקרומולר עם זמן דגירה של 30 דקות.
עבור בדיקת חומצת הגרעין הכתומה, הריכוז האופטימלי הוא מיקרו-מולרית אחת לדגירה של 10 דקות. לאחר השליטה, עבור כל בדיקה מולקולרית, ניתן להשלים את האופטימיזציה תוך יום, אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור את הבדיקות בסביבה יציבה, בתנאי הטמפרטורה, ה-pH והאור המתאימים.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המיקרוביולוגיה לחקור הטרוגניות קהילתית בפיטופלנקטון. לאחר שצפית בסרטון, כעת אתה אמור להבין היטב כיצד לפתח פרוטוקול אופטימלי להערכת פיזיולוגיה תאית באמצעות ציטומטריית זרימה ובדיקות מולקולריות. אל תשכח שעבודה עם בדיקות מולקולריות ואורגניזמים רעילים עלולה להיות מסוכנת ביותר, וכי יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת ה-PPE המתאים, והבנה מלאה של חומרי COSHH, בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול לניתוח מצבים פיזיולוגיים של ציאנובקטריות באמצעות ציטומטריה של זרימה וגששים מולקולריים. השיטה שואפת לקבוע במדויק את שיעור התמותה של תאים בתוך אוכלוסיות מיקרוביאליות, תוך התייחסות לאתגרים הנובעים מהטרוגניות של התאים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- ביולוגיה של התא
- ציטומטריה זרימה
רקע
- אוכלוסיות מיקרוביאליות מראות הטרוגניות תאית משמעותית.
- ציטומטריית זרימה יכולה להעריך מצבים פיזיולוגיים, אך התוצאות משתנות בין מינים שונים.
- מדידה מדויקת של תמותת תאים היא קריטית להבנת קהילות מיקרוביאליות.
- גשים פלואורסצנטיים מותאמים יכולים לשפר את הניתוח ברמת התא הבודד.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול מהימן להערכת פיזיולוגיה של ציאנובקטריות.
- שיפור הדיוק של קביעת תמותת תאים.
- הנגשת ניתוח בזמן אמת של מצבים פיזיולוגיים בציאנובקטריות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ציטומטריית זרימה לניתוח תאים.
- גששים מולקולריים להבחנה בין מצבים פיזיולוגיים.
- אופטימיזציה של הפרוטוקול להשגת תוצאות מדויקות.
- הדגמה על ידי סטודנט לדוקטורט במעבדת ציטומטריה.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מבדיל ביעילות בין מצבים פיזיולוגיים בציאנובקטריות.
- הושגה קביעה מדויקת של תמותיות התאים.
- ניתוח בזמן אמת סיפק תובנות לגבי התנהגות מיקרובית.
- התוצאות תומכות בהבנתה של אוכלוסיות ציאנובקטריות.
מסקנות
- הפרוטוקול שפותח משפר את ניתוח הפיזיולוגיה של ציאנובקטריות.
- הוא נותן מענה למגבלות קודמות במדידת תמותות של תאים.
- ניתן ליישם שיטה זו במגוון מחקרים מיקרוביאליים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
הערכה מדויקת של חיוניות תאית במערכות מיקרוביאליות תומכת בתיקוף יעדים בשלב מוקדם, על ידי מתן אפשרות לסריקה פנוטיפית מהימנה והפחתת סיכונים מכניסטיים. ציטומטריה של זרימה (Flow cytometry) עם גששים מולקולריים אופטימליים מספקת נתונים כמותיים ברזולוציה של תא בודד, המשפרים את הביטחון החזוי במערכות לזיהוי מובילים (lead identification). גישה זו נותנת מענה לאתגרי ההטרוגניות בביולוגיה של גילוי, ומסייעת בקבלת החלטות מבוססות נתונים של go/no-go, ובכך מפחיתה סיכונים ביולוגיים בשלבים מאוחרים בקווי פיתוח של תרופות אנטי-מיקרוביאליות או אנטי-זיהומיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינת היפותזות טיפוליות על ידי הבחנה בין תאים חיוניים לתאים שאינם חיוניים באוכלוסיות מיקרוביאליות.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף של מטרות פונקציונליות באמצעות הערכת שלמות הממברנה בעזרת גששי SYTOX Green ו-SYTOX Orange.
- ערך ניבוי: ריכוזי גששים אופטימליים (0.5 µM ירוק, 1.0 µM כתום) ממזערים תוצאות שגויות שליליות וצביעה לא ספציפית, ובכך משפרים את מהימנות הבדיקה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: יוצרת קריאות פלואורסצנציה סטנדרטיות וניתנות לשחזור עבור סריקת תרכובות בסריקה רחבה (high-throughput) בגילוי חומרים אנטימיקרוביאליים.
- פלט כמותי: מאפשר מדידה מדויקת של ספיגת הגשש כמשתנה תלוי לצורך מידול תגובה למינון.
- قابליות להרחבה: אופטימיזציה של הפרוטוקול ב- Microcystis aeruginosa מספקת מסגרת ניתנת להעברה למערכות ציאנובקטריאליות או מיקרוביאליות אחרות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: תומך במידול פרה-קליני של יעילות אנטימיקרוביאלית על ידי כימות תמותה מושרית-תרכובת בפתוגנים המטרה.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין סריקת חיוניות בשלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני באמצעות נקודות קצה עקביות המבוססות על פלווציטומטריה.
- קידום מותאם סיכון: מפחית עמימות מכניסטית באופטימיזציה של תרכובות מובילות על ידי אספקת נתונים פיזיולוגיים של תא בודד בזמן אמת.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מובילים (leads), ומספקת תובנות מכניסטיות המנחות החלטות לגבי קידום התרכובות.
- ביולוגיה של הגילוי: מסייעת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי מתאם בין טיפול בתרכובת לבין שינויים בחיוניות התאית.
- סריקה: מספקת סטנדרטיזציה ושחזור של הבדיקה באמצעות אופטימיזציה של פרמטרי ריכוז ודגירה של הגשוש.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות פלואורסצנציה כמותיות המאפשרות השוואה סטטיסטית בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: תומכת בהתאמה של סמנים ביולוגיים על ידי קישור קריאות של שלמות הממברנה למנגנון הפעולה של התרכובת.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה רב-שימושית של ציטומטריה הישמה על פני מטרות מיקרוביאליות בתוכניות אנטי-זיהומיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת קריאות שגויות של חיוניות באמצעות אופטימיזציה של הגשש.
- ערך תפעולי: משפר את השחזור והסטנדרטיזציה בין מעבדות באמצעות ריכוזי גשש וזמני דגירה מוגדרים.
- ערך אסטרטגי: משפר את היעילות ההונית על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים מוקדמת של תרכובות חסרות פעילות ספציפית למטרה.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתעדוף מותאם סיכונים על ידי זיהוי תרכובות בעלות השפעות אנטי-מיקרוביאליות אמיתיות לעומת ארטיפקטים של הבדיקה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהפעלת ציטומטריה זרימה ובפיצוי פלואורסצנציה עבור גילוי רב-פרמטרי.
- תלוי בגישה לציטומטרים של זרימה התואמים לייזר של 488 nm ובערוצי גילוי מתאימים לצבעי SYTOX.
- מחייב סטנדרטיזציה של הפרוטוקול בין צוותים כדי להבטיח טיפול, אחסון ויישום עקביים של הגשושית.
- כולל שיקולי התאמה בעת העברת השיטה למודלים בקטריאליים גרם-חיוביים או גרם-שליליים.
- כולל מגבלות מעשיות כגון רעילות של הגשושית והצורך בבידוד בטיחותי ביולוגית בעבודה עם אורגניזמים רעילים כמו Microcystis aeruginosa.
