נוגדן microarray כימי חסומים פרופיל תפוקה גבוהה מרובב של Glycosylation חלבון מסוים בדגימות מורכבות

מאמר וידאו זה מתאר פרוצדורה להשגת פרופילי גליקוזילציה של 20 גליקופרוטאינים שונים במדגם סרום של מטופל עם קרצינומה של תאי הכבד (hepatocellular carcinoma) באמצעות מערך מיקרו-נוגדנים חסום כימית. ראשית, נוגדנים ספציפיים לגליקופרוטאינים מודפסים ישירות על שקופיות של מערך מיקרו, והגליקנים של הנוגדנים נחסמים כדי למנוע קישור של לקטינים. כאשר מדגמי סרום של מטופלים מוחלים, גליקופרוטאינים מהמדגם נלכדים על ידי הנוגדנים. לאחר מכן מתווספים חלבוני קישור לגליקנים בביוטיניציה כדי לזהות את הגליקנים, ומוסיפים NeutrAvidin מצומד לדי-גליקן כדי לסמן את הלקטינים הביוטיניים.

לאחר מכן סורקים את שקופית המיקרו-מערך (microarray) כדי לזהות פלואורסצנציה; ניתוח של הנתונים המתקבלים חושף את פרופילי הגליקוזילציה של חלבוני הדגימה. לטכניקה זו מספר יתרונות על פני שיטות קיימות כגון HPLC. שיטה זו מאפשרת זיהוי של גליקופרוטאינים בודדים במצבם הטבעי.

סריקת שינויי גליקוזילציה עבור חלבונים מרובים בו-זמנית היא מהירה וקלה יותר. מצאנו שסמנים ביולוגיים של מחלות, ובמיוחד של סרטן וסרטן הכבד, אותם בחנו בעיון רב, הם לרוב גליקוזילים. ומצאנו כי היכולת לזהות גליקו-צורות ספציפיות משפרת באופן משמעותי את ביצועי הסמנים הביולוגיים ברגישות ובספציפיות שלהם.

כך מדידה זו יכולה לספק תובנות לגבי שינויים בגליקוזילציה של חלבונים מרובים בסרום במקרי HCC. ניתן ליישמה גם במחקרי פתולוגיה ובגילוי סמנים ביולוגיים בסוגים אחרים של סרטן ומחלות, כגון סרטן הלבלב, סוכרת ומחלת אלצהיימר. את הפרוצדורה תדגים Chen Lu, טכנאית מהמעבדה שלי.

התחילו את הפרוטוקול בהכנת המערך של הנוגדנים (antibody microarray). ראשית, בשפופרות מיקרו-צנטריפוגה של 0.8 מיליליטר על קרח, דללו את כל הנוגדנים שישמשו להדפסת המערך לריכוז של 0.5 milligrams per milliliter במינימום של 40 milliliters של PBS. כאן, 26 נוגדנים שונים ישמשו כביקורת חיובית. הכינו גם כמות זהה של biotinylated BSA בריכוז 0.5 milligrams per milliliter ב-PBS. השתמשו בפיפט כדי להעביר מנות של 40 milliliters מכל נוגדן לפלטת מקור בעלת 384 בארות על קרח.

לאחר מכן, בתוכנת הבקרה של המערך המזערי (microarray), הגדירו את המיקום של כל נוגדן. בשלב הבא, העמיסו את הפלטה על המערך המזערי כמקור. לאחר מכן, העמיסו 20 שקופיות מערך מזערי של נתיבים (path microarray slides) על המערך המזערי כיעד.

הגדירו את מערך המיקרו (microarray) להדפסת 48 מערכים זהים, שבהם 27 נוגדנים וחלבונים של בקרה מודפסים בשלישייה בתבנית של תשע על תשע. הפעילו את הדפסת שקופיות מערך הנוגדנים. אספו את שקופיות מערך הנוגדנים ואחסנו אותן בקסטת שקופיות עם חומר מייבש.

יש לאטום את הקסטה בתוך שקית פלסטיק כדי למנוע דנטורציה של חלבונים והיווצרות לחות על השקופיות במהלך האחסון. אחסנו את שקופיות המיקרו-מערך (microarray) האטומות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס עד למועד השימוש. ההיבט הקשה והחשוב ביותר בהליך זה הוא שלב החסימה הכימית.

כדי להבטיח הצלחה, קריטי שתידפס כמות מספקת של נוגדנים על גבי המערך המיקרוסקופי. יש להכין תמיד sodium IDE ו-agro acid hydrocyte טריים מיד לפני הניסוי. וודאו כי הליך החמצון מבוצע בטמפרטורה של 4°C תוך הימנעות מחשיפה לאור.

הוצא את שקופיות המערך הזעיר (microarray) מהמקרר והשאר אותן להגיע לטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. הוצא שקופית מאריזת האחסון. טבול את השקופית לזמן קצר באגן שטיפה המכיל PBS עם 0.1% tween 20.

לאחר מכן, טבול את השקף בבופר נתרן אצטט 15 millimolar עם 0.1% tween למשך 10 דקות. כעת, הכן תמיסה טריה של 150 millimolar נתרן פריודיד בבופר נתרן אצטט 15 millimolar, והעבר אותה לאמבט שטיפת שקפים. אחסן במקרר, הרחק מהאור עד לשימוש. הוצא את השקף מבופר נתרן האצטט והנח אותו באמבט המכיל נתרן פריודיד טרי, כאשר הצד עם הנוגדנים פונה כלפי מעלה.

כסו את האמבט בנייר אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור. לאחר מכן, הניחו את אמבט השקופיות בטמפרטורה של 4°C עם ניעור עדין למשך שעתיים. הוציאו את השקופית מהאמבט ושטפו אותה קצרה בבופר סודיום אצטט שלוש פעמים למשך חמש דקות.

דגרו את השקף ב-300 milliliters של תמיסת חסימה של 10 millimolar hydro glutamic acid שהוכנה טרי, בתא דגירה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין. הוציאו את השקפים מהתא ושטפו אותם ב-PBS עם 0.1%tween למשך שלוש דקות. לאחר מכן, באגן שטיפת שקפים, דגרו את שקף המיקרו-מערך (microarray) ב-300 milliliters של 1%BSA ב-PBS עם 0.5%tween למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין.

שטפו את העגליות ב-PBS עם 0.1% tween שלוש פעמים למשך שלוש דקות. הניחו את העגליה על מתקן לעגליות וסובבו במהירות של 1,200 ×g למשך שתי דקות כדי לייבש את עגליות המיקרומערך (microarray). על מנת להפריד בין כל תת-מערך, מוטבעה על העגליה רשת שעווה.

לאחר חימום מוקדם של מכשיר הטבעת השעווה בטמפרטורה של 70 °C למשך חמש דקות, הכניסו את שקופית המערך המיקרוסקופי (microarray) החסומה למכשיר, כאשר הצד עם הנוגדנים פונה לעבר השעווה. משכו את הידית בעדינות כדי להטביע את השעווה באופן אחיד על השקופית. ניתן להשתמש בשיטה זו לביצוע בדיקות פרופיל גליקני עבור דגימה בודדת, או למדידה של אפיתופ גליקני בודד במספר דגימות.

כאן נדגים בדיקות של פרופיל גליקנים (glyco profiling assays). התחילו בדילול של 40 µL סרום לתוך 360 µL של PBS המכיל 0.1%tween 0.1%bridge 35 ו-100 µg/mL של IgG מעכבר, חולדה, ארנב, עיז וחמור. נפח זה מספיק להחלת 6 µL של תמיסת סרום מדולת על כל תת-מערך (sub array).

יש להניח בזהירות 6 µL מהדגימה המדוללת או מהביקורת לכל תת-מערך בשקופית. יש להדגיר את השקופית בקססט מלחלח עם ניירות סופג רטובים בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. יש לשטוף את השקופית ב-PBS עם 0.1% tween שלוש פעמים למשך שלוש דקות.

לאחר מכן ייבשו את השקופית על ידי סיבוב במהירות של 1200 $\times$g למשך שתי דקות. הכינו 20 $\mu$L של חלבונים קושרים של גליקנים עם ביוטיניציה בריכוז של 10 mg/mL ב-PBS tween בתוך מבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח 0.8 mL על קרח. טפטפו 6 $\mu$L של הלקטינים הביוטיניליים המדוללים על כל תת-מערך בשקופית והדגירו בקופסת שקופיות לחה עם נייר סופג רטוב בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.

לאחר שטיפת השקופיות ב-PBS עם 0.1% tween שלוש פעמים כפי שנעשה קודם לכן, ייבשו את השקופית על ידי סבוב בצנטריפוגה ב-1200 ×g למשך שתי דקות. הכינו 400 µL של DITE 5 49 labeled neut travain בריכוז 10 mg/mL ב-PBS 0.1% tween בתוך מבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח 0.8 mL על קרח. השתמשו בפיפטור חוזר כדי להניח 6 µL של DITE 5 49 labeled neut travain על כל תת-מערך (sub array), והדגירו את השקופית בקסטת שקופיות הלחות בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת לאחר הדגירה.

שטפו את הזכוכית עם PBS 0.1%tween שלוש פעמים למשך שלוש דקות. ייבשו את הזכוכית על ידי סבוב בנצנטריפוגה ב-1200 ×g למשך שתי דקות. סרקו את הזכוכית באמצעות סורק fluorescence microarray ברזולוציה של 10 millimeter.

יש להגדיר את הגדרות הלייזר וה-PMT כחזקות ככל האפשר, תוך הבטחה שלא תירשם רוויה. פתח את התמונה בתוכנת array Pro 3.2. הגדר את תבנית המערך בהתאם למפת המערך המראה את מיקומי נקודות הנוגדן.

יישרו בזהירות כל מעגל תבנית על הנקודה המתאימה בתמונה, והוציאו את עוצמתה של כל נקודה לקובץ Excel לצורך ניתוח נוסף. מערך מיקרו-נוגדנים הכולל 48 תתי-מערכים זהים עם 26 נוגדנים נגד 20 גליקופרוטאינים של סרום וביוטין BSA תוכנן ויוצר כפי שמתואר בסרטון זה כדי לבחון את חשיבותו של הליך החסימה.

בניתוח של פרופיל גליקופרוטאינים, הוכנו שתי שקופיות מיקרו-מערך (microarray) זהות. אחת לא עברה חסימה כימית, בעוד שהשנייה כן. דגימת ביקורת הוחלה על מערכי ה-subar בעמודות אחת ושלוש, ודגימת סרום מאוחדת של HCC הוחלה על מערכי ה-subar בעמודות שתיים וארבע 22.

לאחר מכן הוחלו לקטינים מעובשרי-ביוטין, הספציפיים לגליקנים שונים, על כל תת-מערך כפי שמוצג בתמונות אלו של תת-המערכים. הלקטינים נקשרו לנוגדנים לוכדים בעמודי הבקרה, מה שיצר רקע גבוה שלא ניתן היה להבחין בינו לבין העמודים שעליהם הוטענו סרומים במערכי מיקרו שלא עברו חסימה. עם זאת, כאשר בוצע אותו ניסוי על שקופית של מערך מיקרו-נוגדנים שעברה חסימה כימית, לא נצפתה קישוריות, או שנצפתה קישוריות נמוכה מאוד, לנוגדנים לוכדים בעמודי הבקרה, בעוד שבעמודים שעליהם הוטענו סרומים נצפתה קישוריות גבוהה של אנטיגנים.

תוצאות אלו מדגימות כי הליך החסימה הכימית הוא שלב קריטי למדידת גליקנים על גבי גליקופרוטאינים שנלכדו על ידי נוגדנים. בעקביות עם הפרוטוקול, ניתן לקבל פרופילי גליקוזילציה של 22 גליקופרוטאינים בסרום של HCC לאחר רכישת המיומנות הנדרשת. טכניקה זו ניתנת לביצוע בתוך שמונה שעות אם היא מבוצעת כהלכה. נוגדנים שעברו מודיפיקציה עלולים לאבד את זיקתם לאנטיגנים שלהם ותכונות אחרות.

לכן חשוב לזכור זאת ולהשתמש במספר נוגדנים שונים ממקורות שונים בעקבות הליך זה. ניתן לבצע מדדים נוספים, כגון זיהוי של ריכוז כל חלבון באמצעות אותה שקופית מיקרומערך (microarray slide), כדי לענות על שאלות נוספות, כגון האם השינוי בגליקוזילציה נובע משינוי ברמות ביטוי החלבון או אך ורק משינוי הגליקוזילציה בכל חלבון בנפרד. אין לשכוח שעבודה עם דגימות סרום המכילות פתוגנים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון שימוש בכפפות מגן, בעת ביצוע הליך זה.