עירור החיצוני של הנוירונים באמצעות שדות חשמליים ומגנטיים ב אחד" ותרבויות דו ממדים

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה לגירוי חשמלי ומגנטי של תרביות חד-ממדיות ודו-ממדיות היא להשתמש בתרביות עצביות ביעילות כמודל מופחת לגירוי מוחי שממנו אנו יכולים להפיק תובנות ופרמטרים חשובים. שימוש בפרוטוקול הגירוי החשמלי שלנו עם תרביות חד-ממדיות מאפשר לנו למדוד פרמטרים ספציפיים הקשורים לעירור עצבי, למשל, כרונקסיה וריאו-בסיס בתאים שונים של הנוירון. טכניקת הגירוי המגנטי מאפשרת לנו להשוות את ההשפעה של שדות מגנטיים לעומת שדות חשמליים על תרביות עצביות.

המודל הזה גם מאפשר לנו לאבחן ולטפל טוב יותר בהפרעות מוחיות. אנו מציעים שיטה יעילה וקלה לתרבית רשתות עצביות דפוס בכל דפוס עיצוב, אפילו רשתות חד מימדיות. לאחר מכן אנו יכולים לכוון שדות מגנטיים חשמליים ומשתנים בזמן ביחס לרשתות אלה כדי להפריד ולצפות בתרומות מתאים שונים של הנוירון.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא אינה דורשת נבדקים אנושיים או מודלים של בעלי חיים המאפשרים חיפוש נרחב וממצה של הפרמטרים הנכונים לגירוי עצבי. ידגימו את ההליך יורי ברנישב, טכנאי מהמעבדה שלי ועמי אייזן, דוקטורנט במעבדה. כדי להתחיל, הכינו תרביות עצביות מעוצבות על ידי זריעת תאים עצביים על כיסויי זכוכית המצופים חלקית מראש בשכבת דחייה ביולוגית.

לשם כך יש לנקות כיסויים של 25 מילימטר. ובעזרת מכונת מקרטעת, מצפים את הכיסוי בשכבה דוחה ביולוגית. התאם את הפרמטרים לתהליך התצהיר ליצירת שכבה המורכבת מסרט כרום דק של שישה עד 10 אנגסטרומים, המבטיח יציבות ציפוי ושכבת זהב בעובי 30 אנגסטרום המספקת לציפוי תגובתיות תיול.

לאחר השלמת התהליך, הסר את הכיסוי ממכונת המקרטע ובדוק את הציפוי שהתקבל. לאחר מכן, הרכיבו מערכת פלוטר עט שונה על ידי החלפת קצה דיו של עט פלוטר במחט תחריט מתכת חדה. הנח יריעת גומי המודבקת לצלחת נוקשה לתוך הפלוטר כך שיובטח משטח יציב וחיכוך גבוה במהלך התחריט.

לאחר מכן, התאם את מיקום הגיליון על ידי לחיצה על הכפתורים המופיעים על הפלוטר. לאחר שיריעת הגומי מונחת במקומה, פיפטה טיפת מים קטנה על פני השטח שלה והנח את הכיסוי המצופה מראש מעל הטיפה. לאחר מכן, באמצעות הפלוטר, חרטו את שכבות המתכת על ידי גירוד חוזר ויוצר קווים בעובי 200 מיקרומטר ליצירת הדפוסים הרצויים.

לפני גירוי חשמלי, הנח את הכיסוי הזרוע בתא הדמיה. כדי לעורר את התאים עם שדה חשמלי בכיוון קבוע, השתמש בשתי אלקטרודות מקבילות המופרדות על ידי 11 מילימטרים וממוקמות בצדדים מנוגדים של התרבית המצופה על גלישות הכיסוי של 13 מילימטר. לאחר מכן, הרכיבו את תא הדמיית התרבות ומחזיק האלקטרודות התואם כך שאלקטרודות החוט טובלות במדיה החוץ-תאית וממוקמות מילימטר אחד מעל התרבית.

לאחר מכן, חבר את זוג האלקטרודות הבודדות למגבר התפעולי המגביר את האות מהגנרטור. החל פולס יחיד של גל מרובע דו קוטבי עם מחזור עבודה של 50% ומשרעת של 22 וולט. השתמש בגל דו קוטבי ללא רכיב DC כדי למנוע אלקטרוליזה שעלולה להתרחש באלקטרודות.

הפעל את הדופק שנמשך בין 10 מיקרו-שניות לארבע אלפיות השנייה כדי להבטיח גירוי יעיל אך למנוע פגיעה בתאים. כדי לעורר את התאים עם שדות חשמליים בכיוון משתנה, השתמש בשני זוגות אלקטרודות בניצב. ודא ששני זוגות האלקטרודות כמו גם מסופי החשמל והניטור שלהם מבודדים חשמלית לחלוטין זה מזה וצפים מהקרקע.

כדי לשנות את כיוון השדה החשמלי, שנה את משרעת המתח המופעל על שני זוגות האלקטרודות. לאחר מכן, קבע את העוצמה והכיוון של השדה המתקבל על ידי חיבור וקטורי. כדי ליצור שדה מסתובב של משרעת קבועה, החל גל סינוס על זוג אלקטרודות אחד תוך הזנת הזוג השני בגל קוסינוס.

כדי להתחיל בגירוי מגנטי, מקם תרבית עצבית, הגדלה בתבנית בצורת מעגל, מתחת למיקרוסקופ. לעורר את התרבית באמצעות סליל גירוי מגנטי מעגלי סטנדרטי וממריץ תומך הזמינים מסחרית. כדי לעורר את התרבויות בעוצמות שדה מגנטי לא סטנדרטיות, חבר סליל גירוי מגנטי בהתאמה אישית לממריץ שנבנה בהתאמה אישית.

לאחר מכן, בעזרת מצביע לייזר, יישר את מרכז התרבית למרכז הסליל כדי להבטיח גירוי מוצלח. התאם את מיקומי הסליל כך שיישאר כחמישה מילימטרים מעל מרכז התרבות. לאחר שסליל הגירוי ממוקם כראוי, טען את הסטימולטור לפוטנציאל של עד חמישה קילו-וולט.

לאחר מכן, באמצעות זרם גבוה, מתג מתח גבוה, שחרר את זרם המתח הגבוה דרך סליל הגירוי כדי ליצור פולס מגנטי המגרה את פעילות הנוירונים המתורבתים. לבסוף, הרכיב סליל איסוף באותו מיקום כמו התרבית העצבית ומדוד את עוצמת השדה המגנטי שנוצר. סכימה זו מראה כי על ידי הפעלת אמפליטודות שונות של פולסי מתח על שני זוגות האלקטרודות, ניתן לכוון את השדות החשמליים לכל זווית ללא צורך בסיבוב ידני של התרבית.

להלן הקלטות לדוגמה של מעברי סידן עם גירוי חשמלי במתחים מיושמים שונים. כאשר מפעילים משך קבוע של שדה חשמלי, מספר הנוירונים שיורים ומגיבים לשדה החשמלי מראה התפלגות גאוס מצטברת כפונקציה של משרעת המתח. וזו דוגמה לעקומת חוזק-משך המתקבלת תוך שימוש בפרוטוקול זה.

עבור תרביות הטבעות המגיבות לשדה המגנטי, שיעור ההצלחה של הגירוי גדל עם רדיוס התרבית. גרף זה מתאר את הקשר בין גודל הטבעת לעוצמת השדה המגנטי. רוב העירורים המוצלחים של התרבויות טמונים בחפיפה בין המרחב של השלב הנגיש לניסוי לבין אזור ההסתברות הגבוהה.

לאחר השליטה, ניתן לבצע הכנת תרביות חד מימדיות תוך שלוש עד ארבע שעות. בעת ביצוע גירוי חשמלי ומגנטי, חשוב לזכור לאפשר התאוששות מלאה של התרבית משלב הגירוי ולוודא שכל הציוד צף ביחס לקרקע החשמלית. על ידי ביצוע הליך זה, ניתן לטפל בשאלות אחרות כמו תרבית נוירונים מאזורים שונים במוח, מדידת סטטיסטיקה, למשל, של נוירונים בקליפת המוח.

אפשרות נוספת היא למדוד פרמטרים של כל נוירון מודל מחלה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו יכולה לסלול את הדרך לאופטימיזציה של הכוח ומשך הזמן הדרושים לגירוי מוחי יעיל ובטוח. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור כל דפוס רצוי של תרבויות עצביות ולהיות מסוגל לעורר אותם חשמלית או מגנטית לחקר אינטראקציות של נוירונים עם שדות אלקטרומגנטיים.