ניתוח אוטומטי של C. elegans התנהגות שח שימוש CeleST תוכנה

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא להעריך כמותית את התנהגות השחייה של C.Elegans באמצעות תוכנת ראייה ממוחשבת הנקראת CeleST, עבור C.Elegans Swim Test"שיטת ניתוח זו יכולה לעזור לטפל בהשפעה של מוטציות גנטיות או התערבויות פרמקולוגיות על התנהגות השחייה של C.elegans. זה גם יכול בקלות לרשום את הירידה הקשורה לגיל בקיבולת הקטרים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שניתן לעקוב אחר מספר בעלי חיים בו זמנית, כאשר היבטים שונים של תנוחת השחייה מנותחים כדי לתת ציון לשמונה פרמטרים של התנהגות שחייה, והערכת נתונים אוטומטית.

התחל בהשגת מיקרוסקופ סטריאו ומצלמת CCD דיגיטלית וכן מחשב עם תוכנת הקלטת וידאו דיגיטלית ותוכנת ראייה ממוחשבת לניתוח התנהגות השחייה של C.Elegans. בתוך תוכנת הקלטת הווידאו הדיגיטלית הגדר את ההגדרות הבאות:כסה את המיקרוסקופ במטלית כהה כדי למנוע סנוור באזור טיפת השחייה בשקופית המיקרוסקופ, ושפר את איכות התמונה. התאם את מרחק העבודה וההגדלה של המיקרוסקופ לתצוגה מלאה של אזור השחייה, והתאם את המראה הבסיסית כדי לקבל ניגודיות חדה של בעלי החיים על הרקע.

לאחר מכן, הגדר את התאורה לשדה כהה כדי לדמיין את גופם של המבוגרים כלבנים על רקע שחור. לאחר מכן, פיפטה 60 מיקרוליטר של מאגר 1 x M9 לתוך טבעת של 10 מילימטר, מודפסת מראש על שקופית מיקרוסקופ, וודא שהטיפה מכסה לחלוטין את האזור הפנימי של הטבעת. העבירו ארבע נמטודות בוגרות לטיפה של מאגר 1 x M9 תוך מזעור הובלת חיידקים שיכולים להעיב על הנוזל.

צמצם את החיידקים בבאר השחייה על ידי מתן אפשרות לנמטודות לזחול לזמן קצר על אזור לא מיושב של הצלחת לפני העברתן, או לערבב מעט את השחייה היטב כדי לפזר עקבות חיידקים קלים לפני הרישום. לאחר מכן, מקמו את המגלשה העמוסה בנמטודות בוגרות על בסיס המיקרוסקופ כדי לתעד את התנהגות השחייה שלהן בנוזל בסרטונים של 30 שניות. כדי להקליט, בחר רצף חדש ב-RAM תחת הכותרת בית, ולאחר מכן לחץ על לחצן ההקלטה האדום.

לבסוף, לאחר השלמת ההקלטה, לחץ על כותרת הבית ובחר ייצוא רצף מלא, על מנת לפצל את הסרטון לרצף של מסגרות תמונה. התחל בהשקת תוכנת ראייה ממוחשבת לניתוח התנהגות שחייה של C.elegans ממעבדת Mat על ידי לחיצה על כפתור ההפעלה. במסך הבית של תוכנית ניתוח השחייה, השתמש בלחצני הוסף סרטון אחד "או הוסף מספר סרטונים" כדי להעלות רצפים של מסגרות תמונה אחת בכל פעם או בקבוצות תוך הצמדת תוויות רלוונטיות, כגון גנוטיפ, תאריך, ניסוי ומשך זמן.

לאחר מכן, לחץ על עבד סרטונים"כדי לאפשר מעקב בו-זמני אחר מספר בעלי חיים ברצפים שהועלו. במסך החדש שמופיע, בחר את הסרטונים הרצויים בתיבה השמאלית ולחץ על הוסף לרשימה"לאחר מכן, סמן את אזור השחייה על ידי בחירת שלוש נקודות בתוך הטבעת והתחל עיבוד על ידי לחיצה על עבד את כל הסרטונים המפורטים לעיל. הצג את התקדמות עיבוד הווידאו בתחתית המרכזית של המסך.

לאחר השלמתו, סגור את מסך עיבוד הווידאו. התחל בלחיצה על אמצעי חישוב"כדי לפתוח מסך חדש שבו ניתן להעלות את הסרטונים המעובדים בזה אחר זה כדי לאמת או לדחות את המעקב אחר בעלי חיים בודדים. השתמש בשלב ידני זה כדי להתמקד באזורים של מעקב שהוחמצ, המוצגים בבלוקים האדומים, ובניגוד למעקב מוצלח, המצוין בבלוקים הירוקים.

מצא את תוקף הגוף המפולח"בסרגל הצבעים הראשון על פני המסך בחצי התחתון. שימו לב שאחוז המסגרות החוקיות מופיע בירוק, ואחוז המסגרות שנדחו מופיע באדום. לאחר מכן, נווט ושנה בלוקים של מסגרות חוקיות או נדחות תוך שימוש באפשרויות הבלוק הבא, החלף תוקף "בלוק מפוצל" ובודד מסגרת".

במקרה הנדיר שבו שני בעלי חיים מצטלבים באזור שחייה לא צפוף, החליפו את מספרי הזיהוי שלהם על פני טווח פריימים ספציפי באמצעות כפתור ההחלפה. לבסוף, לחץ על שמור וחשב אמצעים" כדי לשמור את קלט התוקף לפני העלאת סרטון מעובד נוסף. לאחר מכן בחר סגור"כדי לצאת ממסך אמצעי החישוב.

שימו לב שהתוכנה מחשבת מפות עקמומיות של ביצועי השחייה של בעלי חיים בודדים ברקע וכן את שמונת הפרמטרים המצוינים בהמשך. במסך הבית של התוכנה Computer Vision, לחץ על הצג תוצאות כדי לקבל את פלט הניתוח. לאחר מכן, צור קבוצות מדגם לטיפול סטטיסטי על ידי בחירת רצפי המסגרות המנותחים הרצויים בתיבה השמאלית והעברתם לקבוצת מדגם קיימת חדשה יותר על ידי לחיצה על כפתורי הוסף לדגימה שנבחרה"או הוסף לדגימה חדשה".

לחץ על הצג גרפים עבור דגימות אלה"כדי לעבור למסך שני המציג את הגרפים והנתונים הסטטיסטיים העיקריים של הדגימות עבור כל אחד משמונת הפרמטרים לפי בחירה בחלק העליון של המסך. לאחר מכן, בחר היסטוגרמות דו-ממדיות "כדי להתוות שילובים של כל שני פרמטרים באמצעות המדידה על ציר X ולמדוד בתפריטים הנפתחים של ציר Y בצד שמאל של המסך. לחץ על "סגור" כדי לצאת ולחזור למסך תוצאות התצוגה.

לאחר מכן, בחר בלחצן הייצוא בפינה השמאלית העליונה של המסך כדי לשמור נתונים מספריים מפורטים כקובץ csv לפתיחה ולמניפולציה נוספת בתוכנית גיליון אלקטרוני. לבסוף, בחר סגור"כדי לצאת ממסך תוצאות התצוגה ולחזור למסך הבית. לחץ על יציאה"כדי להבטיח שמירת מסד הנתונים המכיל את רצפי הווידאו המנותחים.

פרמטרים מסוימים של שחייה, כגון קצב התחלת גלים, מדד פעילות, משיכת מכחול ומהירות נסיעה, ירדו בהדרגה עם הגיל אפילו ברקע גנטי חיובי. מצד שני, מספר גלי הגוף, אסימטריה, מתיחה ופרמטרים של סלסול עלו עם הגיל אצל מבוגרים מוטנטיים פראיים ומזדקנים. למרות שכל הנמטודות מתחילות כמבוגרים בריאים, חלקן מאבדות במהירות את הכושר הגופני שלהן, בעוד שאחרות שומרות על מרץ לפרקי זמן ארוכים יותר, מה שמצביע על כך שלמבוגרים רעים יש תוחלת בריאות קצרה משמעותית מאשר למבוגרים חינניים.

לאחר שליטה, ניתן להשיג ניתוח של ארבע תולעי שחייה תוך דקות ספורות. החישוב אורך כשש דקות לכל סרטון, וניתן לבצע אותו מרחוק. ניתן לעבד 250 בעלי חיים ביום.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לרכוש סרטונים של ניסויי שחייה, ולעבד נתונים כדי לקבל הערכה של תנועה בנוזל.