שיטה למדידת מטבוליזם ב ממוינות תת-אוכלוסיות של קהילות Cell מורכבות באמצעות איתור איזוטופ יציב
4 בפברואר 2017
מאמר זה מתאר שיטה לחקר חילוף חומרים תאי בקהילות מורכבות של סוגי תאים מרובים, תוך שימוש בשילוב של מעקב איזוטופים יציב, מיון תאים לבידוד סוגי תאים ספציפיים וספקטרומטריית מסה.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא להשתמש במעקב אחר איזוטופים כדי למדוד את חילוף החומרים של אוכלוסיות ממוינות של קהילות תאים מורכבות. אז בשיטה זו, אנו יכולים לחקור את ההבדלים המטבוליים בין תת-אוכלוסיות של קהילות תאים מורכבות, וגם את שיתוף הפעולה המטבולי בין תת-האוכלוסיות הללו. היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא שעל ידי שילוב של מעקב אחר איזוטופים עם מיון תאים, אנו יכולים לקבל מדד אמין יותר של חילוף החומרים, וגם אנו יכולים לאמת עד כמה השיטה אמינה.
הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שהיא משלבת טכניקות שונות, ואופן הטיפול בתאים ואורך ההליך עשויים להשפיע על חילוף החומרים בתאים. למיצוי מטבוליט מצלחת, תאי תרבית ראשונים בצלחת של שש בארות במדיום תרבית יציב עם תווית איזוטופ המכיל תוספי דיאליזה. כאשר התאים מגיעים למפגש של 75%, שטפו את הבארות פעמיים עם 500 מיקרוליטר של HBSS קר המכיל גלוקוז בתווית אחידה.
לאחר מכן הוסיפו 600 מיקרוליטר של מתנול מקורר מראש של 100% קרח יבש לכל באר, והעבירו את הצלחת לקרח היבש. השתמש במגרד תאים כדי לנתק את התאים ולאחר מכן העביר בזהירות את התמציות מכל באר לצינורות מיקרו-צנטריפוגה בודדים. אחסן תאים במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לניתוח ספקטרומטריית מסה.
למיצוי מטבוליט של תאים ממוינים, תרבית תאים בצלחת של 100 מילימטר במדיום תרבית מסומן עם תוספי דיאליזה, כך שהם יגיעו למפגש של 75% ביום המיון. לתיוג דופק של תאים ממוינים במחזור התא, תרבית התאים במדיום לא מסומן המכיל תוספי דיאליזה עד שהם מגיעים למפגש של 75%. לאחר מכן, סמנו את התאים למשך שעתיים על ידי החלפת המדיום במדיום תרבית מסומן טרי.
שטפו את הכלי ב-HBSS חם המכיל גלוקוז בתווית אחידה, ונתק את התאים עם 1.5 מיליליטר טריפסין EDTA ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר ארבע דקות, השביתו את הטריפסין עם שלושה מיליליטר HBSS קר כקרח המכיל גלוקוז מסומן ותוספי דיאליזה, והעבירו את התאים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר לצנטריפוגה. השעו מחדש את הגלולה ב-HBSS המכילה גלוקוז מסומן, תוספי דיאליזה ו-EDTA בריכוז אחד עד פעמיים של 10 עד שישה תאים למיליליטר, וסנן את התאים דרך מסננת של 40 מיקרון כדי לקבל תרחיף תא בודד.
העבירו את התאים לצינור של חמישה מיליליטר ומינו אותם על ציטומטר זרימה. למיצוי מטבוליט מתאים ממוינים מדומים, יש להוציא את הפסולת החוצה ולמיין רק את הסינגלים. למיצוי מטבוליט מתאים ממוינים במחזור התא, הוצא את הפסולת והכפלות, ומיין תאים ל-G1 ו-SG2M, בהתבסס על הקרינה של בדיקת הג'מינין.
בסוף המיון, אספו את התאים על ידי צנטריפוגה והשעו את הגלולה ב-50 מיקרוליטר מים מזוקקים קרים כקרח לקבלת כדור הומוגני. לאחר מכן חלץ במהירות את המטבוליטים על ידי הוספת 540 מיקרוליטר של מתנול מקורר קרח יבש. אחסן את הדגימה במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לניתוח LCMS.
מיצוי מטבוליטים מתאים ממוינים חייב להיות מתוכנן היטב מראש, כאשר עבודת הניסוי תושלם במהירות האפשרית כדי למזער את השינויים המטבוליים. לניתוח המטבוליטים שחולצו, בחר תחילה מספר מטבוליטים עם תקנים זמינים מתאימים המציגים שיאי דגימה באיכות טובה. לאחר מכן, ודא את איכות הפסגות, הקפד לא לכלול איזוטופים כוזבים.
חשב את איזוטופ המסה מהשברים שלנו עבור הדגימות המסומנות באיזוטופים על ידי חלוקת שטח השיא של כל איזוטופ מסה מהשבר שלנו באזורי השיא הכוללים של כל איזוטופי המסה מהשברים שלנו. לאחר מכן, חשב את שברי הפחמן המסומנים להעשרת פחמן-13 באמצעות הנוסחה להעשרת פחמן. לבסוף, חשב את שברי החנקן המסומנים להעשרת חנקן-15 באמצעות הנוסחה להעשרת חנקן.
בניסוי מייצג זה, 66 מטבוליטים שנבחרו מניתוח הנתונים היו נוכחים בתאים הממוינים המדומים, ש-60 מהם נראו מסומנים באיזוטופ מסה דומה מההתפלגויות שלנו בין תמציות הכלים לתאים הממוינים המדומים. לדוגמה, איזוטופ המסה מהתפלגות הגלוטמט שלנו דומה בין הצלחת לתמציות ממוינות מדומה, מה שמצביע על כך שאיזוטופ המסה של הגלוטמט מההתפלגות שלנו אמין גם באוכלוסיות תאים ממויינות. ניתוח של תאי HELA הממוינים לשלבי מחזור התא G0, G1 או SG2M באמצעות בדיקת הגמינין FUCCI חושף תיוג ציטידין בשתי האוכלוסיות עם העשרה גבוהה יותר בשלב SG2M, העולה בקנה אחד עם סינתזה מוגברת של נוקלאוטידים במהלך שלב S.
בניסוי זה, איזוטופ המסה מההתפלגות שלנו הציג את אותו דפוס בשני השברים הממוינים של מחזור התא, מה שמרמז על כך שנעשה שימוש באותו מסלול סינתזה, אך הוא פעיל יותר בשלב SG2M, מה שמדגים כי ניתן לזהות בקלות הבדלים מטבוליים בשיטה זו, אפילו בין תת-אוכלוסיות קשורות זו לזו. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחלץ מטבוליטים משברים ממוינים, ולהבין את האזהרות. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לטפל בתאים במהירות במהלך המיון ומיצוי המטבוליטים, מכיוון שאופן ומשך הזמן שבו התאים מטופלים יכולים להשפיע על חילוף החומרים שלהם.
לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך חמש שעות. ניתן להחיל הליך זה על סוגי תאים אחרים. לדוגמה, תת-קבוצות של תאים חיסוניים בדם, או סוגים שונים של תאים בתוך גידול, תוך שימוש במגוון בדיקות, נוגדנים או שיטות צביעה למיון.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה לחקר חילוף חומרים תאי בקהילות מורכבות של סוגי תאים מרובים. הטכניקה משלבת מעקב אחר איזוטופים יציבים, מיון תאים ומספקטרומטריית מסות כדי לנתח הבדלים מטבוליים ושיתופי פעולה בין תתי-אוכלוסיות.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום המדע
- מטבוליזם תאי
- מעקב איזוטופי
- ספקטרומטריית מסות
רקע
- הבנת המטבוליזם בקהלי תאים מורכבים היא חיונית למחקרים ביולוגיים שונים.
- מעקב באמצעות איזוטופים מאפשר ניתוח מפורט של מסלולים מטבוליים.
- מיון תאים מסייע בבידוד סוגי תאים ספציפיים לצורך מדידות מדויקות יותר.
- ספקטרומטריית מסות מספקת זיהוי רגיש של מטבוליטים.
מטרת המחקר
- למדידת המטבוליזם של אוכלוסיות ממוינות בתוך קהילות תאים מורכבות.
- לחקירת הבדלים מטבוליים בין תתי-אוכלוסיות.
- לבחינת שיתופי פעולה מטבוליים בין סוגי תאים שונים.
שיטות שהשתמשו בהן
- תרביתו תאים במצע המסומן באיזוטופים יציבים.
- מיינו סוגי תאים ספציפיים באמצעות טכניקות למיון תאים.
- השתמשו בספקטרומטריית מסות לניתוח מטבוליטים.
- אששו את מהימנות השיטה באמצעות הדגמות חזותיות.
תוצאות עיקריות
- הבנה משופרת של הבדלים מטבוליים בתתי-אוכלוסיות של תאים.
- הדגמת שיתוף פעולה מטבולי בין סוגי תאים שונים.
- תיקוף של מהימנותה של השיטה המשולבת.
- אספקת מסגרת ויזואלית להליך ולהשפעתו על מטבוליזם של תאים.
מסקנות
- השיטה מציעה גישה חסונה לחקר המטבוליזם התאי.
- שילוב של מעקב אחר איזוטופים עם מיון תאים מספק נתונים מטבוליים מהימנים.
- ניתן ליישם טכניקה זו בתחומי מחקר מגוונים הכוללים אינטראקציות תאיות מורכבות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו נותנת מענה לאתגר מרכזי בביולוגיה של הגילוי: השגת מדידות מטבוליות מהימנות מאוכלוסיות תאים הטרוגניות ללא הכנסת ארטיפקטים הנגרמים מתהליכי מיון. באמצעות שימוש במעקב אחרי איזוטופים יציבים והתפלגויות איזוטופומרים של מסה (MIDs), היא מאפשרת הפחתת סיכונים בתיקוף מטרות (target validation) באמצעות הערכה בטוחה יותר של פעילות מסלולים ספציפיים לתתי-אוכלוסיות. הגישה תומכת בביטחון חיזוי בשלבים מוקדמים של הגילוי על ידי הבחנה בין הבדלים מטבוליים אמיתיים לרעש פרוצדורי, ובכך מספקת תובחנות לקבלת החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) בסינון תיקי הפרויקטים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות על ידי חשיפת הבדלים מטבוליים בין תתי-אוכלוסיות, כגון סינתזה מוגברת של נוקלאוטידים בשלב SG2M לעומת שלב G1.
- ערך תפעולי: מספק שלב תיקוף באמצעות בקרים שעברו מיון דמה (mock-sorted) כדי לאשר ש-MIDs נותרים ללא שינוי למרות הלחץ הנובע מהמיון, ובכך מבטיח את שלמות הנתונים לפני ניתוחים המשכיים.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי אישור עקביות המסלול (למשל, סינתזה של נוקלאוטידים), תוך כימות הבדלי פעילות בין מצבים קרובים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות למשמעות הבדיקה: מייצר קריאות MID כמותיות וניתנות לשחזור מfracciones ממוינות, המתאימות לספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה וניתנות להרחבה על פני קבוצות דגימות.
- מוכנות לסריקה: מכין מערכות ביולוגיות מתוקפות להערכת תרכובות על ידי קביעת פרופילים מטבוליים בסיסיים בתתי-אוכלוסיות מוגדרות.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: ניתן להתאים את זרימת העבודה — השילוב של סימון איזוטופי, מיון ו-LC-HRMS — לתתי-קבוצות חיסוניות או לסביבות מיקרו של גידולים באמצעות גששים חלופיים או שיטות צביעה שונות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשר בין פרופיל מטבולי של שלב הגילוי לאישוש פרה-קליני, על ידי מתן אפשרות למדידה עקבית של פעילות מסלולים באוכלוסיות ממוינות במגוון מודלים ניסיוניים.
- קידום מותאם סיכונים: מסייע בתיעדוף של מטרות או מנגנונים המבוססים על תלות מטבולית ספציפית לתתי-אוכלוסיות, ובכך מפחית הובלה למסקנות שגויות בשלבים מאוחרים יותר.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ומספקת רזולוציה מטבולית המשלימה את ניתוח תתי-האוכלוסיות הגנומי והפרוטאומי.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהבהרת מסלולים ובהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי בידוד אותות מטבוליים ספציפיים לתתי-אוכלוסיות ממוינות, כגון שלבים במחזור התא.
- סריקה: מספקת נתונים כמותיים של העשרת מטבוליטים המוכנים לבדיקה (assay-ready), המאפשרים השוואה מהימנה של השפעות תרכובות על פני פראקציות מוגדרות.
- אנליטיקה: מייצרת התפלגויות איזוטופומריות של מסה ופראקציות פחמן/חנקן מסומנות המשמשות כקריאות יציבות ומשולבות בזמן להערכת שטף במסלול.
- מחקר תרגומי: מאפשרת רציפות מניתוח אוכלוסיות ממוינות in vitro למודלים פרה-קליניים על ידי שמירה על נאמנות המצב המטבולי באמצעות תיקוף מבוסס MID.
- שימוש חוזר ארגוני: מקריבה פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לצורך פנוטיפיקה מטבולית של כל תת-אוכלוסייה הניתנת למיון, ובכך מפחיתה פיתוח שיטות כפול ומסורב בין פרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת עמימות מכניסטית במערכות הטרוגניות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה באמצעות בקרות פנימיות (דגימות המדמות מיון) המאמתות את העמידות המתודולוגית.
- ערך אסטרטגי: משפר את היעילות ההונית על ידי מתן אפשרות לקבלת החלטות go/no-go מוקדמות ומדויקות יותר, המבוססות על תלויות מטבוליות ספציפיות לתת-אוכלוסיות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים על ידי הדגשת פגיעות מטבוליות במצבי תא מובחנים, ובכך מספק מידע לאסטרטגיות של טיפול משולב או סממנים ביולוגיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בסימון באיזוטופים יציבים, מיון באמצעות ציטומטריה של זרימה וניתוח נתוני LC-HRMS לחישוב העשרה של מטבוליטים.
- תלוי בגישה לממייני תאים, פלטפורמות לספקטרומטרית מסות ומדיות מסומנות באיזוטופים עם תוספים שעברו דיאליזה.
- מחייב נהלי טיפול סטנדרטיים כדי למזער סחף מטבולי במהלך המיון והמיצוי, במיוחד עבור דגימות רגישות לזמן.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום השיטה על תאים ראשוניים או רקמות בעלי רמות שונות של שבריריות או יעילות מיון.
- כולל מגבלות מעשיות, כגון הצורך במיצוי מהיר של מטבוליטים לאחר המיון כדי למנוע שינויים מטבוליים ex vivo, כפי שצוין בפרוטוקול.
