זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשתמש בשיטה הידועה כטיהור זיקה טנדמי (Tandem affinity purification) כדי לבודד שותפים קושרים של חלבונים. שלום, אני dLAN Bailey מהמחלקה לוירולוגיה ב-Imperial College London. במעבדה שלנו, אנו חוקרים אינטראקציות בין וירוסים למארחים עבור חברים שונים ממשפחת הווירוסים.

זיהוי חלבונים המקיימים אינטראקציה עם חלבונים תאיים או ויראליים אחרים הוא נקודת התחלה מצוינת לחקירת הגומלין בין הווירוס למארחו במהלך זיהום. בסרטון זה, אסביר גישה אחת שבה אנו משתמשים במעבדה שלנו, טיהור טנדמי ואפיני (tandem and affinity purification) או סימון TAP. תג ה-TAP המשמש במחקר זה הוא תג N-טרמינלי המורכב משתי יחידות של חלבון G ופפטיד קושר strep-avidin.

אלה מופרדים על ידי רצף קיטוע של פרוטאז TEV המאפשר אלוציה ספציפית של חלבון הפיתיון. בדוגמה זו, eIF4E עכברי נמצא בקצה ה-C של מבנה היתוך זה. פרוטוקול תיוג ה-TAP הוא הליך בן שישה שלבים.

לאחר טרנספקציה ויצירת שורות תאים, התאים עוברים השראה לביטוי חלבון ה-tag לפני שהם מולתים בבופר ליזיס עדין. שני שלבים של טיהור זיקה ושני תמיסות ספציפיות משמשים לטיהור הפיתיון (bait) וכל שותף פוטנציאלי לאינטראקציה לצורך יצירת שורות תאים. יש לבצע טרנספקציה לתאי HEC 2 93 באמצעות וקטור הביטוי P met four המקודד.

תאי חלבון הפיתיון המסומנים ב-tap נבחרים לאחר מכן באמצעות 100 µg/ml של hygromycin B. מכיוון שהפלסמיד נשמר כ-episome, אין צורך בבידוד של שיבוטים ספציפיים. 10 בקבוקונים של תאים בצפיפות מלאה (confluent) עוברים אינדוקציה על ידי טיפול ב-10 µM של cadmium chloride למשך 16 שעות, לפני שנגרדים אל תוך המצע. התאים התלויים מועברים לאחר מכן לצינורות 15 M, והתאים מרוכזים למשקע באמצעות סנטריפוגציה.

תאים אלו נשטפים לאחר מכן שלוש פעמים ב-PBS קר בקרח לפני שהם מרוכזים בסוף לתהליך סבסבציה (pelleting). בשלב השני, ליזיס של התאים, התאים עוברים ליזיס ב-5 mL של חוצץ ליזיס (lysis buffer) קר באמצעות פיפטאות חוזרות, ולאחר מכן נשארים על קרח למשך חמש דקות. כדי להבטיח ליזיס יעיל, התאים מועברים באמצעות מזרק דרך מחט קהה בעלת קוטר צר ועוברים מחזור של הקפאה והפשרה (freeze thaw).

את התוצאה מחלקים למבחנות של 1.5 mil ומסירים תאים לא מומסים ושיירי רקמה באמצעות צנטריפוגציה. יצוין כי גודל המשקע פוחת באופן ניכר לאחר שלב צנטריפוגציה זה. את העלייה של התמיסות המומסות מאחדים לאחר מכן במבחנת Falcon של 15 mil ומעבירים דרך מסנן של 0.45 micrometer להסרת שיירי רקמה נוספים.

יש לקחת מנות (aliquots) של 50 µL מליזאט זה לצורך ניתוח עוקב. דגימה זו תיקרא דגימה אחת. שלב שלוש, קישור ל-rabbit IgG Aeros.

בשלב זה של הפרוטוקול, תגי protein G משוקקעים חיסונית באמצעות חרוזי rabbit IgG. כדי להקצות את חרוזי ה-aros, הסר את הקצה של טיפ הפ pipette. פעולה זו מסייעת במניעת נזק לחרוזים.

שחזר בעדינות את תמיסת ה-rabbit IgG aro על ידי סיבוב של הבקבוק לפני העברת ה-aros למבחנה של 15 mil. שטוף את ה-aros שלוש פעמים בבופר ליזיס מקורר, תוך שימוש בצנטריפוגה במהירות נמוכה כדי להשקיע את החרוזיים בכל שלב. חרוזי ה-rabbit IgG שהשקיעו צריכים להיות גלויים לאחר הצנטריפוגה.

לאחר כל שלב, יש להסיר בזהירות את הבאפר מבלי להפריע לחרוזים. לאחר השלמת השטיפה האחרונה, יש להוסיף את הליזאט המסונן והמזוקק לחרוזים הדחוסים ולהדגיר למשך שלוש שעות או למשך הלילה. מומלץ לבצע זאת בטמפרטורה של 4 °C באמצעות מערבל מסובב.

לאחר האימונו-פרסיפיטציה (immunoprecipitation), סובבו במהירות (spin down) את כדוריות האגרוז והסירו את supernatant לצורך ניתוח בהמשך. במידת הצורך, ניתן להשתמש בקצה טיפ דק כדי להסיר כל שארית נוזל מהמבחנה. supernatant זה הוא דגימה שתיים שלב ארבע: שסוע פרוטאז TEV.

בשלב זה, הפיתיון מנותק מתגיโปรטאין G. שלב זה מאפשר ניתוק ספציפי של חלבון הפיתיון, המהווה למעשה שלב אלוטיה (elution) מתוך שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) של IgG של ארנב. הכינו את תערובת הניתוק של TEV והוסיפו אותה לחרוזי ה-aros באמצעות קצה של טיפ שהוסר, העבירו תערובת זו למבחנה מיקרו-צנטריפוגה סיליקונית והפכו אותה כדי להביא את ה-aros לסuspended לפני דגירה למשך לילה בטמפרטורה של 4°C, הסירו אליקוט מתגובת הניתוק של TEV זו לצורך אנליזה.

זוהי דוגמה שלוש. דגירה לילה על מערבל מסובב אמורה לאפשר לתגובת ה-TEV להתקדם עד להשלמה כמעט מלאה. שלב חמישה, קישור להסרטה של חרוזי strept avidin.

בשלב זה, פיתי ה-Cleve וכל שותפי קישור פוטנציאליים עוברים טיהור באמצעות זיקה (affinity purification) מהתמיסה. ראשית, סבבו בצנטריפוגה את תגובת השחרור של TEV המכילה את חרוזי ה-aros rabbit IgG. כדי לשקע את ה-aros, הסירו נפח קטן של העלייה המזוכלת לצורך אנליזה.

זוהי דוגמה ארבע. הסר בזהירות את כל supernatant שנותר, המכיל את חלבון הפיתיון שלך, אל מבחנה נקייה. שוב, השתמש בעדין.

יש להשתמש בטיפים של פפיתה (peppe tips) כדי להסיר את כל העלייה (supernatant) האפשרית. יש לשמור את חרוזי ה-rabbit IgG aros לצורך ניתוח עוקב. זהו דגימה חמש.

כדי למנוע נזק לחרוזי ה-strep adin, הסר את הקצה מטיפ pet. השהה בעדינות את החרוזים והעבר aliquote למבחנה סיליקונית. שטוף את חרוזי ה-strep בעזרת S buffer, והשגהו שליות באמצעות סרכוז במהירות נמוכה.

לאחר כל שטיפה. לאחר כל שטיפה, הסירו בזהירות את התמי समाधान (buffer). חרוזי Streptavidin הם קטנים מאוד ועלולים לזוז בקלות, גם כאשר משתמשים בפיפט קטן.

הכינו את טיפולי ה-pet. לאחר שטיפת חרוזי ה-strept adin, הוסיפו את הנוזל העליון (supernatant) מתגובת השחרור של ה-TEV לחרוזים אלו, והדגירו את התגובה למשך שלוש שעות או למשך לילה בטמפרטורה של 4°C, באמצעות מערבל מסתובב.

לאחר הדגירה, סבב במ centri-fuge את חרוזי ה-streptavidin והסר את העל-נוזל (supernatant). זהו דגימה שש. לתשומת לבכם.

חלבון הפיתי (bait protein) קשור כעת לחרוזי השארית שבמבחנה. שטפו את חרוזי הסטריפטאבידין המכילים את חלבון הפיתי שלכם בעזרת תמיסת ליזיס. כדי להסיר חלבונים מזוהמים נוספים, הסירו את תמיסת השטיפה שנותרה מהחרוזים והשאירו אותם על קרח.

שלב שש, אלוציה של ביוטין. בשלב זה, מוסיפים ביוטין לחרוזי הסטראפטיווידין. האינטראקציה בין הביוטין לחרוזי הסטראפטיווידין דוחפת את הפיתיון, אשר חוזר לתמיסה.

הוסיפו את תמיסת הביוטין ישירות לחרוזים והפכו את המבחנה כדי לערבב. דגרו את התגובה בטמפרטורה של ארבעה °C למשך שלוש שעות או למשך הלילה באמצעות צנטריפוגת ערבוב מסתובבת, ערבבו את תערובת הביוטין ואספו בזהירות את התערובת למבחנה נקייה. זהו ה-EIT הסופי שלכם, המכונה דגימה שבע.

חרוזי ה-strept havein הנותרים הם עבור דגימה שמונה. בשל ריכוז החלבון הנמוך שבה, יש לרכז את האלוציות הסופית זו לפני הניתוח. פעולה זו מתבצעת באמצעות עמודי ספין עם סף חיתוך למשקל מולקולרי נמוך, תוך הפחתת הנפח על ידי צנטריפוגציה ומעקב קבוע אחר התהליך.

ניתן לפצל דגימה רכזת זו ולנתח אותה בג'לי SDS-PAGE באמצעות צביעת kumasi וכסף. אם הדגימות מיועדות לניתוח באמצעות ספקטרומטריית מסה, אנו ממליצים להשתמש בג'לים מסחריים מוכנים מראש. לאחר מכן ניתן לחלץ פסים בודדים ולזהות את החלבונים באמצעות ספקטרומטריית מסה.

במקרה זה, הפיתיון היה עכברי, EIF עבור חלבון E. היתרון במערכת ה-tap הוא היכולת לבטא את החלבון המבוקש בקו תאים ספציפי, ותלוי בקו התאים שבו אתם מעוניינים, היא מאפשרת גם לבטא את החלבון ברמות נמוכות יחסית, לפי בחירתכם, כאשר כל המודיפיקציות הפוסט-טרנסלציוניות והמיקום התאי נשמרים, כך שניתן לרוב לנקות את הקומפלקס הטבעי.