Quadunple Immunostaining של הנורה חוש הריח עבור ויזואליזציה של חוש הריח חושפת אקסון מולקולרית קודי זהות

המטרה הכוללת של שיטת צביעה אימונוהיסטוכימית זו היא לדמיין ביטוי משולב של מולקולות מיון אקסונים בקצה האקסון של נוירונים חושי ריח. שיטה זו יכולה לסייע באפיון תהליכים מרכזיים בתחום התפתחות חוש הריח, כגון הנחיית אקסונים, תצורות סינפסות והתחדשות נוירונים חושיים של חוש הריח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת למדענים להשוות ולנתח את דפוסי הביטוי של מולקולות מיון אקסונים בפקעת הריח מבלי לקיים שונות בין חלקים.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלב ההטמעה, מכיוון שקשה לתאר במילים את המיקום והזווית של דגימת רקמות הריח בתבנית. התחל עם ראשים מעכברים בני שבוע עד שבועיים שתוקנו על ידי זלוף תוך לב של 4% פרפורמלדהיד. הכנס להב מספריים לחלל שבין השיניים העליונות והתחתונות, וחתוך אופקית כדי להסיר את עצם הלסת התחתונה.

לאחר מכן חתוך רקמות עודפות בעזרת מלקחיים ומספריים, כדי לעזוב את רקמת הריח, כולל פקעת הריח ואפיתל הריח. טבלו את רקמת הריח ב-PBS כדי להסיר אוויר בחלל האף, ואז בצעו חתך אנכי כדי להסיר את החלק האחורי של המוח, והניחו את רקמת הריח בתחתית תבנית הטבעה כשהקצה החתוך פונה כלפי מטה. מלאו את התבנית בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית, ולאחר מכן טבלו בחנקן נוזלי.

לאחר שהרקמה וה-OCT קפואים לחלוטין, יש לאזן את הרקמה בקריוסטט ב-20 מעלות צלזיוס למשך שעה. כעת הכינו חלקים פרזגיטליים סדרתיים של נורת הריח עם הקריוסטט, ואספו אותם על ידי הדבקה לשקופיות זכוכית מצופות MAS. לאחר ההדבקה יש לייבש את השקופיות מיד עם מייבש שיער.

התחל צביעה חיסונית על ידי שטיפת השקופיות המיובשות עם PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. חסום אתרי קשירה לא ספציפיים על ידי דגירה של השקופיות למשך שעה עם תמיסת חסימה של 5% בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הוסף 400 מיקרוליטר של קוקטייל של נוגדנים ראשוניים מדוללים בתמיסת חסימה של 1% לכל שקופית.

דגרו את המגלשות למשך הלילה בטמפרטורת החדר. למחרת, השליכו את תמיסת הנוגדנים העיקרית ושטפו את השקופיות עם PBST שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הוסף 400 מיקרוליטר של קוקטייל של נוגדנים משניים ו-PBS לכל שקופית.

יש להגן מפני אור ולדגור במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, השליכו את התמיסה ושטפו שוב את השקופיות שלוש פעמים למשך חמש דקות כל אחת עם PBS בטמפרטורת החדר. לבסוף, כיסוי הרכבה מחליק על השקופיות על ידי מריחת שתי טיפות של מדיום הרכבה על כל מגלשה, הנחת החלקת הכיסוי והסרת בועות אוויר.

השג תמונות פלואורסצנטיות עם מיקרוסקופ הקרינה באמצעות המסנן המתאים לכל פלואורופור. התאם את זמן החשיפה כדי לקבל אותות פלורסנט של התמונה ללא רוויה. הגדר את המבנה הגלומרולרי על ידי אותות אימונופלואורסצנטיים של GLUT2.

השתמש בתמונה J כדי למדוד את עוצמות הצביעה של מולקולות מיון אקסונים בתוך גלומרולים. תמונה זו מציגה קטע של פקעת ריח פרה-סאגיטלית מעכבר בן שבועיים עם נוגדנים נגד VGLUT2, Kirrel2 מוצג באדום, Semaphorin 7A מוצג בירוק ו-OLPC בכחול. התמונה הממוזגת מדגימה כי מולקולות מיון האקסונים המעורבות בהפרדה גלומרולרית באות לידי ביטוי בתבנית פסיפס בלתי תלויה במיקום.

כל גלומרולוס מוגדר על ידי אותות פלואורסצנטיים של הסמן הפרה-סינפטי VGLUT2. המבנים הגלומרולרים מוקפים בקווים מקווקוים. עוצמות האותות של מולקולות מיון אקסונים נמדדו בכל גלומרולוס.

כפי שניתן לראות כאן, מולקולות מיון אקסונים מתבטאות באופן דיפרנציאלי בכל גלומרולוס. לדוגמה, לגלומרולוס 3 יש רמות גבוהות של OLPC, רמות ביניים של סמפורין 7A ורמות נמוכות יותר של Kirrel2, וניתן לכמת את ההבדל הזה על ידי מדידת עוצמת הצביעה. ואילו לגלומרולוס 4 יש רמות גבוהות של OLPC, ורמות נמוכות יותר של Kirrel2 ו-Semaphorin 7A.

שוב, ניתן לכמת את ההבדל הזה על ידי מדידת עוצמת הצביעה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשמיט קיבוע לאחר עם PFA, וטיפול בתמיסת סוכרוז, המומלצים בדרך כלל. אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד למקם יותר גלומרולי על החלק של פקעת הריח היחידה, וכיצד לבצע צביעה חיסונית באיכות גבוהה עם נוגדנים מרובים, שאפשר ליישם על אזורים אחרים במוח.

אל תשכחו לקוות, שיטה זו תעזור לכם להצליח בניסויים העתידיים שלכם.