פרוטוקול בשלב אחד עבור הערכת המצב של מוות של תאים Clonogenic קרינה הנגרמת על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ

המטרה הכוללת של בדיקה זו היא להעריך את האופנים העיקריים של מוות תאים קלונוגניים הנגרמים על ידי קרינה מייננת בהתבסס על המורפולוגיה האופיינית של גרעינים צבועים ב-DAPI. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הקרינה. היתרון העיקרי של טכניקה מהירה וחסכונית זו הוא שניתן להעריך בו זמנית את האופנים העיקריים של מוות תאים קלונוגני הנגרם על ידי קרינה מייננת.

בדרך כלל, אנשים חדשים בביולוגיה של קרינה יתקשו להעריך מוות תאי קלונוגני המושרה על ידי קרינה מכיוון שנדרשות בדיקות שונות כדי להעריך כל אופן של מוות תאי. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר ביצענו סריקה בקנה מידה גדול של מוות תאי קלונוגני המושרה על ידי קרינה באמצעות קווי תאים מרובים ומינוני קרינה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ביולוגיה של קרינה, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות, כגון כימותרפיה לסרטן.

מי שידגים את ההליך יהיה משתף הפעולה שלנו, אטסושי שיבטה. התחל בעיקור אזמל עם מגבות נייר לחות באתנול 70%. לאחר מכן השתמש באזמל כדי להניח פתק כיסוי בצלחת תרבית תאים בגודל 35 מילימטר.

לצלחת התרבות עם תלוש הכיסוי, הוסף מיליליטר אחד של מדיום תרבות. כעת החזיקו בעדינות את מרכז הכיסוי להחליק בעזרת מלקחיים סטריליים ושאבו את מדיום התרבות מהמנה לחלוטין. לאחר מכן, הכינו תרחיף תאים של שלושה מיליליטר במדיום תרבית בצינור של 15 מיליליטר.

הוסף את תרחיף התאים לצלחת התרבות. ודגרו אותו למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. ודא שהתאים מחוברים להחלקת הכיסוי וחיים על ידי בדיקתם תחת מיקרוסקופ ניגוד פאזה הפוך.

כעת הקרינו את המנה בשישה קרינת רנטגן אפורים. לאחר ההקרנה, דגרו את התאים באינקובטור למשך 72 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. כעת קח את התאים מהחממה ושאף את מדיום התרבות מצלחת התרבות.

חותכים את קצה המיקרו פיפטה בנפח 1,000 מיקרוליטר כחמישה מילימטרים מהקצה בעזרת מספריים. והשתמש בו כדי להוסיף מיליליטר אחד של תמיסת קיבוע לצלחת התרבות. מרחו את תמיסת הקיבוע לאורך קירות צלחת התרבות כדי למזער את הנזק לתאים.

לאחר מכן העבירו את צלחת התרבות הזו לכלי תרבות מרובעת ונערו אותה בעדינות כדי לפזר באופן שווה את תמיסת הקיבוע על החלקת הכיסוי. לאחר מכן, דגרו את המנה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את תמיסת הקיבוע מהצלחת.

כעת הוסיפו שני מיליליטר PBS לאורך קירות המנה. ואז לשאוף את ה-PBS. כדי להתכונן לצביעה DAPI, הוסף חמישה מיקרוליטר של מגיב צביעה DAPI על שקופית זכוכית.

לאחר מכן הסר את החלקת הכיסוי מהכלי בעזרת אזמל. ורוקנו עודפי PBS על פתק הכיסוי על ידי נגיעה בקצה פתק הכיסוי במגבת נייר. כעת הרכיב את החלקת הכיסוי הפוכה על טיפת מגיב הצביעה DAPI על שקופית הזכוכית כך שהתאים ייחשפו למגיב הצביעה DAPI.

לבסוף, בדוק את התאים המוכתמים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במסנן DAPI. מוצגות מורפולוגיות גרעיניות בכל אחד משלושת האופנים של מוות תאי. תאים אפופטוטיים נראים בעלי גרעינים מעובים.

אונות מרובות נצפות בגרעינים של תאים העוברים קטסטרופה מיטוטית. נראה כי תאים העוברים הזדקנות מציגים מוקדי הטרוכרומטין אופייניים הקשורים להזדקנות. מוצגת תצפית השוואתית של גרעינים וגרעינים מוקרנים בשישה קרני רנטגן אפורות.

עיגולים מצביעים על גרעינים שעוברים אפופטוזיס, וחצים מציינים גרעינים שעוברים קטסטרופה מיטוטית. מוצגת הערכה של כ-300 גרעינים הנתונים להקרנה בהשוואה למדומה. נראה כי הקרנת קרני הרנטגן של שש האפורים גורמת לקטסטרופה מיטוטית בתדירות גבוהה יותר של כ-25% ואחריה אפופטוזיס בכ-5% ואירועי הזדקנות נדירים מאוד.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעה אחת אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לא לפגוע בתאים על ידי מריחת תמיסות ישירות על החלקות הכיסוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ניתוח זרימה ציטומטרי או חלבוני סמן מוות תאי, כמו גם צביעת בטא-גלקטוזידאז הקשורה להזדקנות כדי להעריך את ההזדקנות כדי להבין עוד יותר כל מצב של מוות תאי קלונוגני.