מבוסס על מערך השוואתי גנומית הכלאה פלטפורמה יעילה לזיהוי של עותק מספר וריאציות במוטציות מהר ניוטרון-induced אספסת truncatula
8 בנובמבר 2017
פרוטוקול זה מספק צעדים ניסיוני ומידע אודות ריאגנטים, ציוד וכלים לניתוח לחוקרים המעוניינים בביצוע ניתוח הגנום כולו מבוסס על מערך השוואתי גנומית הכלאה (CGH) של עותק מספר וריאציות צמחים.
המטרה הכוללת של פרוטוקול הכלאה גנומי השוואתי מבוסס מערך זה היא לזהות במהירות וריאציות של מספר עותקים במוטציות הנגרמות על ידי הפצצת נויטרונים מהירה של צמח הקטניות Medicago truncatula. שיטה זו עוזרת לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הקטניות. כגון, הקלה על זיהוי אמפתוגנים באתר נמוך המעורבים בוויסות התפתחות גושים בקטניות.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא בעלת המוניטין הגבוה ביותר ורגישה באיתור וריאציות של מספר עותקים כגון מוטציות מחיקה במוטציות הפצצת הנויטרונים של צמח הקטניות Medicago truncatula. מי שמדגים את ההליך הזה יהיו אני, והונגצ'נג וואנג, רופא מארח עמיתים מהמעבדה הגנטית. הקפיאו במהירות גרם אחד של רקמת עלים צעירה שנאספה מצמחים בודדים בחנקן נוזלי.
לאחר מכן, השתמשו במכתש ועלי וטחנו את רקמת העלים הקפואה לאבקה דקה בתוך החנקן הנוזלי. חלץ את דגימות ה-DNA הגנומי הפראי והמוטנטי מהאבקה העדינה באמצעות ערכת בידוד DNA. השתמש בצינורות צנטריפוגות של 500 מיקרוליטר כדי לדלל מיקרוגרם אחד מכל סוג בר ו-DNA גנומי מוטנטי במים מזוקקים כפולים לנפח סופי של 20 מיקרוליטר.
לאחר מכן, הוסף חמישה מיקרוליטרים של פריימר אקראי לצינורות הצנטריפוגה. מערבל במהירות את הצינורות, ולאחר סיבוב מהיר למטה הנח אותם בתרמו-סייקלר למשך 10 דקות כדי לנטרל את דגימות ה-DNA ב-98 מעלות צלזיוס. לאחר 10 דקות הסר את הצינורות מהתרמאופקלר והניח אותם מיד על מי קרח למשך חמש דקות.
לאחר מכן, הכינו שתי תערובות תיוג והוסיפו 25 מיקרוליטר של תערובת תיוג כאחד ושניים לצינורות ה-DNA מסוג הפראי והמוטנטי בהתאמה. פיפטה את הדנ"א והתווית מתערבבים שלוש פעמים, ואז מסובבים לזמן קצר את הצינורות. לאחר הסיבוב, דגרו את הצינורות בתרמו-סייקלר ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים, ולאחר מכן ב-65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי לנטרל את האנזים אקסו קלנוב.
לאחר מכן, הוסף 430 מיקרוליטר של One X TE Buffer, וערבב את התוכן בכל צינור. לאחר מכן, סובב בקצרה את הצינורות והעביר את התמיסה בצינורות לעמודי טיהור עם שני צינורות איסוף מיליליטר. צנטריפוגה את עמודי הטיהור ב 14, 000 פעמים G למשך 10 דקות והשליכו את הזרימה דרכם.
הוסף 480 מיקרוליטר של One X TE Buffer לכל עמודה, ושוב צנטריפוגה ב-14,000 פעמים G למשך 10 דקות. השליכו את הזרימה. העבירו כל אחד מה-DNA המסומן בסוג הבר והמוטציה מתחתית העמודה לצינורות צנטריפוגות חדשים.
לאחר מדידת הנפח של כל אחד מה-DNA המסומנים עם הפיפטה, התאם את הנפח הסופי ל-80 מיקרוליטר עם One X TE Buffer, ולאחר מכן מדוד את ריכוז ה-DNA המסומן בספקטרופוטומטר. לאחר מכן, ערבבו כמויות שוות ערך של DNA מוטנטי ובר כדי להכליא בדיקות על שבב מיקרו מערך להכלאה השוואתית. הביאו את הנפח הסופי ל-160 מיקרוליטר עם One X TE Buffer.
לאחר מכן, הכינו את תמיסת ההכלאה ופיפטה אותה שלוש פעמים כדי לערבב היטב שלושה סוכנים עם DNA מעורב. לאחר סיבוב קצר של הצינורות דגרו אותם בתרמו-סייקלר בטמפרטורה של 98 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ובטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. זכור להגדיר את הטמפרטורה ל 67 מעלות צלזיוס כדי לחמם מראש את תנור ההכלאה ארבע שעות לפני ההכלאה.
לאחר מכן, הנח שקופית אטם על בסיס תא ההכלאה והעמיס עליו 490 מיקרוליטר מתמיסת ההכלאה לאחר 20 דקות של דגירה ב-37 מעלות צלזיוס ב-thermocycler. כדי ליצור את תא ההכלאה, כסו את שקופית האטם בשבב מיקרו מערך הגנום של Medicago truncatula, ולאחר מכן כסו את תא ההכלאה והדקו אותו היטב בעזרת המהדקים. דגרו את תא ההכלאה המורכב בתנור ההכלאה בחום של 67 מעלות צלזיוס למשך 40 עד 48 שעות.
בינתיים, הכינו שני כלי כביסה עם 250 מיליליטר של מאגר כביסה אחד שנשמר בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו שקופית אחת לשטיפת כלים עם מאגר כביסה שניים נשמרים ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הכינו צנצנת כביסה אחת עם 70 מיליליטר אצטוניטריל, וצנצנת כביסה נוספת עם 70 מיליליטר תמיסת ייצוב וציור.
הנח את שתי צנצנות הכביסה במכסה אדים בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה הסר את תא ההכלאה מתנור ההכלאה ושחרר את מהדקי החדר לפתיחת המכסה. לאחר מכן, הסר את שבב מערך המיקרו בשקופית האטם והנח אותם על כלי כביסה עם Wash Buffer One.
בודד את שבב מערך המיקרו משקופית הכיסוי. לאחר מכן, העבירו את שבב מערך המיקרו לכלי הכביסה של השקופית השנייה עם Wash Buffer One. מערבבים בעדינות את התמיסה על צלחת ערבוב מגנטית בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.
הנח את שבב מערך המיקרו על כלי הכביסה עם מאגר כביסה שני שחומם מראש, ולאחר מכן ערבב עם מוט הערבוב כדי לשטוף את התמיסה ב-37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. הסר את שבב מערך המיקרו והנח אותו בצנצנת הכביסה המכילה אצטוניטריל במכסה אדים לשטיפה למשך 30 שניות. העבירו את שבב מערך המיקרו לצנצנת הכביסה עם תמיסת ייצוב וייבוש ושטפו שוב למשך 30 שניות.
הסר בזהירות את השבב וייבש במשך דקה אחת בתוך מכסה האדים. סרוק את שבב מערך המיקרו באמצעות סורק ברזולוציות של שתי מיקרומטר. תוכנת מיפוי אותות שימשה כממשק לניתוח ההתפלגות של שני יחסים מנורמלים של אותות מוטנטיים לעומת אותות פראיים על פני שמונה כרומוזומים.
עבור מחיקות משוערות, הערך של יחס לוג שניים שווה או קטן ממינוס שתי נקודות חמש, נלקחת בחשבון סטיית תקן. ניתוח פילוח של התוכנה מדגים אזור מחיקה משוער של 22 קילו-בסיס בכרומוזום 4 המוצג בגרף. ניתוח גבולות המחיקה המוקפים בבדיקות מערך המיקרו מראה יחס ממוצע מנורמל מופחת של לוג שניים.
הגרף מציג גם שישה גנים מבוארים אחרים כולל גן הבן המקיף את האזור שנמחק. גן הבן אחראי על בקרת קשריות ב-Metecago truncatula. לאחר מכן, הגברת PCR שנעשתה כדי לאשר את גבולות המחיקה מציגה תוצר של נקודה וחמישה קילו-בסיס מוגבר ממוטציה FN6191, אך לא בסוג הפראי.
ריצוף ה-DNA נעשה כדי להראות את צומת המחיקה במוטציה FN6191 המוצגת בחץ השחור. נעשה גם רצף שאישר את מיקום גבולות המחיקה. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך 72 שעות אם היא מבוצעת כראוי.
כדי להשיג נתונים באיכות גבוהה, זכור לשמור על ריכוז אוזון נמוך בחדר בו מבצע את ההליך. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע אמצעים אחרים כגון תגובות שרשרת פולימראז של כל ריצוף הגנום כדי לענות על שאלות נוספות כמו הגודל ומספר העותקים בגנום. אירוע ואימות של טכניקה זו סללו את הדרך לחוקרים לחקור את השונות במספר העותקים שהם גורמים למוטציות ואת הגרסאות הטבעיות במיני צמחים שאינם ניתנים למוטגנזה החדרתית כגון Garden P. אל תשכח שעבודה עם אצטוניטריל, ייצוב ותמיסת ייבוש עלולה להיות מסוכנת ביותר.
אמצעי זהירות, כגון לבישת מגן עיניים, הימנעות ממגע ישיר עם הסוכנים ועבודה זהירה הם חיוניים לחלוטין.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט את השלבים לביצוע אנליזת הכלהה גנומית השוואתית (CGH) מבוססת מערך של הגנום השלם, לצורך זיהוי וריאציות במספר העותקים בצמחים, ובפרט ב-Medicago truncatula. שיטה זו שימושית במיוחד עבור חוקרים הלומדים ביולוגיה של קטניות והתפתחות קשרי שורשים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- גנטיקה של צמחים
- גנומיקה השוואתית
- ביולוגיה של קטניות
רקע
- וריאציות במספר העותקים (Copy number variations) הן קריטיות להבנת השונות הגנטית.
- הפצצה בנייטרונים מהירים גורמת למוטציות בצמחים.
- Medicago truncatula משמשת כמרכיב מודל למחקרי קטניות.
- זיהוי מוטציות יכול לסייע בהתקדמות חקלאית.
מטרת המחקר
- לזיהוי וריאציות במספר העותקים במוטנטים של Medicago truncatula.
- להקל על המחקר של התפתחות קשריים בקטניות.
- להעמיק את ההבנה של מנגנונים גנטיים בצמחים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הibridization גנומית השוואית (CGH) מבוססת מערכים של הגנום המלא.
- איסוף רקמת עלים מצמחים בודדים.
- הקפאת דגימות בחנקן נוזלי לצורך שימור.
- ניתוח של וריאציות במספר העותקים (copy number variations) במוטנטים מושריים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של מוטציות מחיקה במוטנטים.
- הדגמת הרגישות של טכניקת ה-CGH.
- אספקת תובנות לגבי הבקרה הגנטית של התפתחות הפקעות.
- תיקוף הפרוטוקול עבור יישומים מחקריים עתידיים.
מסקנות
- פרוטוקול ה-CGH יעיל למחקר של וריאציות גנטיות בצמחים.
- זיהוי וריאציות במספר העותקים עשוי להוביל להתקדמות בביולוגיה של קטניות.
- ניתן להחיל שיטה זו על מיני צמחים אחרים למחקרים דומים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת זיהוי מהיר של וריאציות במספר העותקים (copy number variations) במוטציות של צמחים, ובכך תומכת בתיקוף מטרות במינים שאינם מתאימים למוטגנזה השגרית (insertional mutagenesis). היא מספקת גישה ניתנת להרחבה (scalable) עבור גנומיקה תפקודית בביולוגיה של קטניות, ומקלה על בדיקת היפותזות וסריקה פנוטיפית. הפלטפורמה מגבירה את הביטחון החזוי בשלבים מוקדמים של הגילוי על ידי אפיון של וריאנטים מבניים שעשויים להשפיע על תפקוד הגנים ועל פעילות מסלולים ביולוגיים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ בביופרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות על ידי זיהוי אירועי מחיקה ושכפול בגנים המטרה.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות זיהוי ישיר של וריאנטים מבניים באוספי מוטציות.
- ערך ניבוי: מסייע במיון תיקי פיתוח על ידי קישור שינויים במספר העותקים לתוצאות פנוטיפיות במערכות הרלוונטיות למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מכין דגימות DNA גנומי שעברו תיקוף להמשך היברידיזציה וניתוח כמותי של האות.
- שחזוריות: סטנדרטיזציה של תנאי הסימון וההיברידיזציה כדי להבטיח זיהוי עקבי של וריאציות במספר העותקים.
- מדרגיות: מאפשר סריקה של ספריות מוטנטים בתפוקה גבוהה באמצעות היברידיזציה גנומית השוואתית מבוססת מערכים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשרת בין אפיון מוטנטים לתיקוף פנוטיפי במודלים של קטניות, ובכך תומכת בהתאמת סמנים ביולוגיים.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מבהירה את תפקוד הגן על ידי קישור וריאנטים מבניים למסלולי קישרין, ובכך מפחיתה את אי-הוודאות בתיקוף המטרה.
- קידום מותאם סיכונים: מספקת בסיס להחלטות "המשך/עצור" (go/no-go) על ידי אישור הנוכחות והגבולות של מוטציות מחיקה בגנים מועמדים.
שילוב זרימת עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מסריקת מוטציות ועד לזיהוי מובילים (leads), ומאפשרת אפיון מהיר של וריאנטים מושריים לפני ביצוע בדיקות תפקודיות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי זיהוי שינויים במספר העותקים העלולים לשבש את מינון הגנים או רשתות בקרה.
- סריקה: מספק פלטי של יחס log-two כמותי המאפשרים השוואה בין פרופילים גנומיים של מוטנטים לעומת סוג בר.
- אנליטיקה: מאפשר ניתוח סגמנטציה להגדרת גבולות המחיקה והערכת גודל הווריאנט, ובכך מסייע בזיהוי מדויק של הווריאנט.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים גנומיים לתוצאות פנוטיפיות, כגון פגמים בנודולציה, ובכך תומך ברצף פרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לניתוח אוכלוסיות מוטנטים במספר מיני צמחים ובאסטרטגיות מוטגנזה שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה על ידי אספקת ראיות ישירות לשינויים במספר עותקי הגן.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של סימון DNA, היברידיזציה ושטיפה.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי הפחתת ההסתמכות על שיטות שיבוט מבוססות מפה עתירות עבודה לצורך אפיון מוטציות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של מוטנטים עם וריאנטים מבניים מאושרים למחקר המשך.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות של מיצוי חומצות גרעין, סימון והיברידיזציה של מערכי מיקרומערך (microarray).
- תלוי בגישה למערכים גנומיים בצפיפות גבוהה ותנורי היברידיזציה עם בקרת טמפרטורה מדויקת.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים לאיכות ולריכוז ה-DNA כדי להבטיח עוצמות אות הניתנות להשוואה.
- כולל טיפול בריאגנטים מסוכנים כגון acetonitrile, הדורש שימוש במכסות מly וציוד מיגון אישי.
- מוגבל למינים עבורם קיימות פלטפורמות מיקרומערך של גנום מלא; עשוי להידרש ביצוע התאמות עבור אורגניזמים שאינם אורגניזמי מודל.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:00
DNA Isolation, Labeling, and Purification
4:04
Hybridization, Washing, and Scanning of the Genome Arrays
6:45
Results: Array-based Comparative Genome Hybridization to Detect Copy Number Variations in Medicago truncatula Mutants
8:09
Conclusion
