האף הפרש הפוטנציאלים לכמת תחבורה טרנס-אפיתל יון בעכברים

ההבדל בפוטנציאל האף הוא שיטה חשובה לאפיון הפנוטיפ של עכברים טרנסגניים המדגמנים סיסטיק פיברוזיס. הוא מאפשר לחקור את יעילותם של סוגים חדשים של טיפולים בסיסטיק פיברוזיס. היתרונות העיקריים של הטכניקה הם בכך שהיא מספקת מדידות אמינות בעכברים המתרבים ברציפות.

זה מפחית את התמותה הקשורה וזה מאפשר לחזור על הניסוי באותה חיה. כדי להכין את צנתר האף עם לומן כפול, שמור את אמצע צינור פוליאתילן באורך 20 ס"מ בלהבה כ-10 עד 15 שניות עד שהוא רך מספיק למשיכה. לאחר מכן, משוך את שני הקצוות זה מזה כדי לקבל צינור נימי דק מאוד באורך של כ -15 סנטימטרים וקוטר חיצוני של 0.1 מילימטרים עבור בדיקת האף.

לאחר מכן, נקו ושומנים את שני הנימים באתנול טהור. חבר אותם עם סרט והדביק אותם יחד באמצעות דבק ציאנואקרילט. חותכים את האורך העודף של הבדיקות בעזרת סכין גילוח כדי לקבל את צנתר הלומן הכפול באורך של כשמונה סנטימטרים.

לאחר מכן, הזריקו מים דרך שני הלומנים כדי לוודא שהם חדירים, וסמנו במרחק של חמישה מילימטרים מהקצה. לאחר מכן, הכינו תערובת שמנת על ידי ערבוב קרם האלקטרוליטים ותמיסת אשלגן רוויה של שלוש טוחנות ביחס של אחד לאחד, תוך הימנעות מהיווצרות בועות אוויר זעירות. עבור מערך הניסוי, כדי למנוע היפותרמיה במהלך הבדיקה ולאחריה, השתמש בשתי כריות חימום, אחת למערך המדידה, והשנייה לקופסה בה יונח בעל החיים להתאוששות בתום הבדיקה.

הפעל את המחשב, המחובר לזיכרון הנתונים, עכבת כניסה גבוהה ומד מתח ברזולוציה גבוהה. לאחר מכן פתח את התוכנה ללכידת נתונים. חבר את האלקטרודות למד המתח.

טובלים את קצה האלקטרודות יחד בתערובת השמנת. בדוק את ערך קיזוז האלקטרודה הראשוני ודחה את האלקטרודות אם הערך גדול מפלוס מינוס שני מילי-וולט. לאחר מכן, הפעל את המשאבה הפריסטלטית והכנס את צינור המשאבה ללומן המחלחל של קטטר האף.

מלאו לומן אחד של קטטר האף בתערובת קרם אלקטרוליטים דרך קצה פיפטה של 10 מיקרוליטר. התאם את הקטטר למחבר צינור סיליקון, ומלא את המחבר בתערובת שמנת. לאחר מכן, הכנס את האלקטרודה החיובית למחבר.

בדוק את ערך היסט גשר האלקטרודה המדידה ודחה את הגשרים אם הערך גדול מפלוס מינוס שני מילי-וולט. לאחר מכן, חבר את היציאה הפרוקסימלית של צינור המשאבה לבקבוקון המכיל את התמיסה שנבחרה לזלוף האף. לאחר מכן חבר את היציאה הדיסטלית של צינור המשאבה ללומן הזלוף של קטטר האף.

לאחר מכן, מלאו את הלומן השני של קטטר האף בתמיסה טרייה A1. טבלו את קצה קטטר האף בתמיסה המכילה בקבוקון A. הפוך את כיוון המשאבה הפריסטלטית כדי למלא את אורך צנתר האף המתאים ל-10 שניות של זלוף. לאחר מכן, קפלו יריעת רקמה סופגת ליצירת כרית ברוחב שלושה סנטימטרים שתשמש כתמיכה לראש העכבר. מכסים את כרית החימום ביריעת הרקמה הסופגת.

לאחר מכן, הניחו את העכבר על גבו על כרית החימום, והדביקו את הגפיים והזנב לכרית. לאחר מכן, הכנס את צנתר הייחוס התוך ורידי לחלל התת עורי של הגפה האחורית. הסר את המחט והתאם למחבר צינור הסיליקון.

מלאו את הקטטר והמחבר בתערובת שמנת. לאחר מכן, חבר את אלקטרודת המדידה החיובית לצנתר האף, ואת אלקטרודת הייחוס השלילית לקטטר המוחדר לחלל התת עורי בגפה האחורית של החיה. לאחר מכן, תקן את הקטטר ואת האלקטרודה עם סרט כנדרש כדי למנוע תזוזה כלשהי.

לאחר הנחת אלקטרודת הייחוס והגשרים, ודא שוב את ערך קיזוז גשר אלקטרודת המדידה על ידי טבילת קצה קטטר האף בתערובת קרם האלקטרודה בתוך המחבר של צנתר העירוי. רשום את ערך ההיסט היציב והסופי. כעת, תקן את אוזני העכבר עם סרט על כרית החימום בחלל פנוי בין שתי חתיכות הרקמה הסופגת.

תקן את החיוניות מבלי לגעת בעיניים. כדי לספוג נוזלים מחלל הפה, הזיזו את הלשון הצידה והכניסו פתיל מחודד של נייר פילטר כסנטימטר אחד לתוך הפה. כדי לספוג נוזלים שיוצאים מהנחיר המנופח, הניחו פיסת נייר סינון שנייה על הצעצוע של האף.

בדוק את ערך הבקרה החיובי של פוטנציאל האפיתל על ידי הנחת קצה קטטר האף בחלק הפנימי של הפה. החזק אותו עם מלקחיים עדינים ותחת תאורה ישירה טובה, הכניס בעדינות את קטטר האף לנחיר אחד, עד ארבעה עד שישה מילימטרים מקצה האף. חמש דקות לאחר הזרקת תרופות ההרדמה, הטה בעדינות את כרית החימום בכ-30 מעלות כשראש החיה כלפי מטה.

עקוב אחר ערך ה-PD הבסיסי המקסימלי. כאשר הוא יציב במשך 30 שניות, התחל לחלחל את רירית האף במהירות של 10 מיקרוליטר לדקה עם ארבע התמיסות המבודדות ברצף. יש להחדיר את התמיסה הראשונה למשך 10 שניות, וכל תמיסה הבאה למשך חמש דקות, או עד להגעה למתח יציב.

הפסיקו לזלזל בפורסקולין כאשר תגובת פורסקולין החולפת מתחילה לרדת. לאחר ההערכה, שחרר את העכבר מכרית החימום. יש לתת אותו עם תערובת אנטגוניסט ההרדמה ולהעביר אותו לקופסת ההתאוששות עם כרית חימום עד להחלמה מלאה.

להלן המעקב המייצג אחר PD באף מעכבר הומוזיגוט, רגיל ועכבר הומוזיגוטי עבור מוטציית CFTR מחיקת F508, יחד עם הערכים הבודדים שהתקבלו עבור פרמטרי PD באף. תגובת אמילוריד היא ההבדל בין הערכים של PD באף בסוף ובתחילת הזלוף של רירית האף עם תמיסת מלח בסיסית המכילה אמילוריד. תגובה נטולת כלוריד היא ההבדל בין ערכי PD באף בסוף ובתחילת הזלוף של רירית האף עם תמיסת מלח חוצצת ללא כלוריד, בתוספת אמילוריד.

תגובת פורסקולין היא ההבדל בין הערכים של מחלת פרקינסון באף בסוף ובתחילת הזלוף של רירית האף עם תמיסת מלח חוצצת ללא כלוריד, בתוספת פורסקולין ואמילוריד. תגובת כלוריד כוללת היא סכום שני הפרמטרים האחרונים המתקבלים תחת זילוף כלוריד אפס. הפרויקט יכול לשמש כדי לחקור, לספק את עריקי ההובלה בעכבר, אך גם בפרחח, בגדול ובמודל סיסטיק פיברוזיס חמוס.

ועריקי הובלת נתרן במודל עכבר הסריס. ניתן ללמוד את כל המובילים על ידי אימוץ הפרוטוקול. העבודה בחלל האף של מכרסמים עדינה ביותר בגלל הדופן החיונית של קלט חושי מאזור הפנים באף.

מוות הולם של הרדמה הוא מינון מאתגר במיוחד כאשר פועלים בחלל האף של העכבר.