בניית פלסמידים CRISPR וזיהוי יעילות נוקאאוט בתאים יונקים באמצעות מערכת כתב לוציפראז כפול
5 בדצמבר 2020
כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר שיטה יעילה עבור הדור היעיל של פלסמידים המבטאים הן את אנזים CRISPR והן את RNA מדריך יחיד (sgRNAs). שיתוף פעולה של תאים יונקים עם וקטור sgRNA / CRISPR זה וקטור כתב לוציפראז כפול הבוחן תיקון הפסקה דו-גדילי מאפשר הערכה של יעילות נוקאאוט.
פרוטוקול זה מתאר את שלבי המפתח בהידור ואופטימיזציה של וקטורים יעילים של sgRNA. ההקדמה שלנו של מועמד sgRNA מטרות זמן יחסי והסקת מסקנות. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא מאפשר לנתח את רשמי קידוד ה- DNA עבור כל אחד מה- sgRNAs מבלי לערוך גנים אנדוגניים.
ניתן להחיל שיטת בחירה מוקדמת זו גם על אמצעים אחרים לעריכת גנים באמצעות הפסקות דו-לוגיות. התחל על ידי דילול oligonucleotides lyophilized לריכוז סופי של 10 micromolar במים מזוקקים כפולים. ערבבו קדימה ואחורי אוליגונוקלאוטידים בצינור PCR דק-קירות ביחס של אחד לאחד מבלי להוסיף מאגר נוסף.
להחגירה את התערובת ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולאחר מכן רמפה למטה את הטמפרטורה ל 72 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הסר את תערובת oligonucleotide ממכונת PCR ולאפשר לו להתקרר בטמפרטורת החדר. לעיכול וקטור pX330-xCas9, עם Bbs1, שלבו את מאגר הווקטור, האנזים והעיכול בנפח של 50 מיקרוליטר והדקירה את התגובה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
לאחר ביצוע טרנספורמציה התא, לבחור חמש עד 10 מושבות חיידקים מהצלחת LB ולהשתמש בכל אחד מהם כדי לחסן מיליליטר אחד של מדיה LB עם 60 מיליגרם אמפיצילין בצינור 1.5 מיליליטר. ואז להדרגר את הצינורות על שייקר סיבובי במשך שעתיים עד שלוש שעות. בצע PCR כדי לסנן עבור פלסמידים רקומביננטי כמתואר בכתב יד טקסט, ולאחר מכן להפעיל את המוצרים על 2%Agarose ג'ל תחת 10 וולט אחוזים.
לאחר זיהוי הפלסמידים החיוביים, השתמש בהם, יחד עם וקטור כתב, כדי לבצע חילוף שותף של קו תא מתאים. כדי ללת את התאים, הסר את מדיום הצמיחה מהתאים התרבותיים. בעדינות לשטוף את פני השטח של כלי התרבות עם PBS ולחלק 100 microliters של PLB לתוך כל תרבות היטב כדי לכסות לחלוטין את שכבת מונו התא.
תן את הצלחת דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות, ולאחר מכן להעביר את lysate לצינור או בקבוקון להמשך טיפול או אחסון. כדי לבצע את בדיקת הלוציפראז הכפולה, תכנת את הזוהר לספק השהיה של שתי שניות לפני הקריאה ואחריה תקופת מדידה של 10 שניות. לאחר מכן, מחלקים 100 מיקרוליטרים של לוציפראז מסאי רגנט למספר המתאים של צינורות לומינומטר.
בזהירות להוסיף 20 microliters של lysate התא לתוך צינור זוהר ומערבבים על ידי צינור פעמיים או שלוש פעמים. מניחים את הצינור בלומינומטר ויוזם את הקריאה. הסר את צינור הדגימה מהלומינומטר.
מוסיפים 100 מיקרוליטרים של עוצרי ים ומערבולת לזמן קצר כדי לערבב. מחזירים את הדגימה ללומינומטר ויוזם קריאה. הקלט את פעילות רנילה לוציפראז, מנורמלת לפעילות פיירפלי לוציפראז, במיוחד הגומלין של היחס המוצג על המסך.
השלך את צינור התגובה בסיום. שיטה זו שימשה ליצירת שלושה וקטורים sgRNA עבור כבשים DKK2 אקסון 1. sgRNA ו- xCas9 וקטורים מבטאים נבנו על ידי עיכול מראש של עמוד השדרה הווקטור ואחריו קשירה בסדרה של שברי DNA קצרים, כפולי גדילים באמצעות זוגות אוליגו חישול.
שבע מושבות חיידקים הוקרנו עם PCR מונחה זוג פריימר ספציפי ואת המושבות החיוביות זוהו. יכולות מיקוד הגנים של pX330-xCas9 T1, T2 ו- T3 זוהו בו-זמנית עם המוצג הכפול של לוציפראז. וקטור SgRNA האחרון הציג את אות הגילוי הגבוה ביותר ולאחר מכן שימש למחקר עריכת גנים כבשים.
בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לבצע בדיקות T7EI או מוצג ריבונוקלאז. אמצעים נוספים אלה מעניקים רשמים מדויקים יותר של עריכת גנים אנדוגניים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה להפקת פלסמידים המבטאים את אנזים ה-CRISPR ו-RNA מנחה יחיד (sgRNAs) נלווה. השיטה מאפשרת להעריך את יעילות ה-knockout באמצעות טרנספקציה משותפת עם וקטור דורג (reporter) של לוקיפראז כפול.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- עריכה גנומית
- טכנולוגיית CRISPR
- בניית פלסמיד
רקע
- יצירה יעילה של וקטורי sgRNA היא קריטית לעריכה גנטית.
- הפרוטוקול מאפשר ניתוח של רשמי DNA מקודדים ללא עריכה של גנים אנדוגניים.
- בחירה מוקדמת של יעדי sgRNA עשויה לשפר את יעילות העריכה.
- ניתן להחיל שיטה זו על מדדי עריכה גנטית שונים.
מטרת המחקר
- אספקת פרוטוקול ליצירת וקטורי sgRNA יעילים.
- סיוע בניתוח יעילות ה-sgRNA בעריכת גנים.
- ייעול התהליך להערכת יעילות הנוק-אאוט (knockout).
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דילול של אוליגנוקלאוטידים ליופיליזים לריכוז סופי של 10 µM.
- ערבוב של אוליגנוקלאוטידים קדמיים (forward) ואחוריים (reverse) בתוך מבחורת PCR.
- טרנספקציה משולבת של תאי יונקים עם וקטור sgRNA/CRISPR ווקטור דוח (reporter vector).
- הערכת יעילות תיקון של שברים דו-גדיליים.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מאפשר ייצור יעיל של וקטורי sgRNA.
- ניתן להעריך ביעילות את יעילות השבוב (knockout).
- בחירה מוקדמת של יעדי sgRNA משפרת את תהליך העריכה.
- השיטה ישימה לאסטרטגיות עריכה גנטית אחרות.
מסקנות
- פרוטוקול זה מספק גישה מהימנה ליצירת וקטורי sgRNA.
- הוא מאפשר ניתוח של עריכה גנומית ללא שינוי של גנים אנדוגניים.
- ניתן להתאים את השיטה ליישומים שונים בעריכה גנומית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בנייה יעילה של וקטור sgRNA והערכה מהירה של יעילות השביתה (knockout) הן קריטיות להאצת תיקוף מטרות מבוסס CRISPR בקווי גילוי מוקדמים. מערכת ד双-luciferase reporter מאפשרת סריקה כמותית של sgRNAs מועמדים לפני השלב האנדוגני, ובכך מפחיתה את השקיעה בזמן ובמשאבים לפני ביצוע עריכה גנטית מלאה. תהליך עבודה זה תומך במיון הפורטפוליו על ידי תיעדוף sgRNAs בעלי פוטנציאל העריכה הגבוה ביותר עבור יישומים המשכיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחירה מוקדמת ומהירה של sgRNAs בעלי יעילות עריכה גבוהה לפני הת targeting של גנים אנדוגניים.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של המטרה באמצעות כימות תיכון של שברים דו-גדיליים באמצעות בדיקות דגישה (reporter assays).
- מפחית עמימות מנגנונית על ידי בידוד ביצועי ה-sgRNA במערכת נשלטת.
- מסייע בביטחון חיזוי בבחירת ריאגנטים של CRISPR למחקרים עוקבים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספק קריאה כמותית וסטנדרטית לפעילות של sgRNA באמצעות יחסי לוקיפראז כפולי.
- משפר את השחזוריות של הבדיקה ואת היכולת להשוות בין sgRNAs מועמדים.
- מאפשר סריקה ניתנת להרחבה (scalable) של מספר מבני sgRNA במקביל.
- מכין וקטורי sgRNA/CRISPR שעברו תיקוף עבור תהליכי עריכת גנים המשכיים.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- מתאם את בחירת ה-sgRNA עם היעדים התרגומיים על ידי הבטחה שרק ריאגנטים בעלי יעילות גבוהה ימשיכו הלאה.
- תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מזעור עריכות כושלות במודלים רלוונטיים למחלה.
- מפחית סיכונים במחקרים פרה-קליניים באמצעות ביצוע הערכת יעילות של ה-sgRNA בשלב מוקדם.
שילוב תהליכי עבודה ופייפליין
שיטה זו משתלבת בממשק שבין הגילוי המוקדם לזיהוי המוליכים (lead identification), ומאפשרת בחירה יעילה של sgRNA לפני עריכה של גנים אנדוגניים ומחקרים תפקודיים המשכיים.
- ביולוגיה של תגליות: מקלה על בדיקת היפותזות ובחינת מסלולים על ידי מתן אפשרות לסריקה מהירה של יעילות sgRNA.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות וניתנות לשחזור המבוססות על לוסיפראז לצורך השוואת sgRNA.
- אנליטיקה: מספקת יחסי לוסיפראז כפוליים מנורמלים כדי לדרג באופן אובייקטיבי את ביצועי ה-sgRNA.
- מחקר תרגומי: מבטיחה שרק sgRNAs מאושרים בעלי ביצועים גבוהים יעברו למודלים רלוונטיים למחלה או למודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר עבור תיקוף sgRNA על פני מספר מטרות גנים ופרויקטים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית את אי-הוודאות המכניסטית בבחירת רכיבי CRISPR.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של סריקת sgRNA ומאיץ את לוחות הזמנים לבניית וקטורים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go ואת הקצאת ההון על ידי תיעודוף של sgRNAs בעלי יעילות גבוהה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קידום מותאם סיכונים ומפחית כישלונות בשלבים מאוחרים עקב עריכה גנטית לא יעילה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בשיבוט מולקולרי, טרנספקציה של תאים וביצוע בדיקת לוסיפראז.
- נדרשת גישה לציוד PCR, אלקטרופורזה של ג'ל ומדיד לומנס (luminometer).
- דורש סטנדרטיזציה של תנאי הבדיקה ונורמליזציה של נתונים בין צוותים שונים.
- ניתן להתאמה לקווי תאים ממליים שונים וליעדי גנים שונים באמצעות אופטימיזציה מתאימה.
- תלוי בתכנון מדויק של אוליגוניוקלאוטידים ובהכנת וקטורים לקבלת תוצאות הדירות.
