שיטות מחקר לכלורופלסט: בדיקת מיקוד, מיקום ואינטראקציות של חלבוני כלורופלסטים
15 באוגוסט 2019
ברוכים הבאים לאוספי שיטות JoVE על שיטות מחקר כלורופלסט, שנבחרו על ידי העורך האורח שלנו, פול ג'רוויס. אוסף זה מכסה מגוון רחב של טכניקות במבחנה ובחיים המאפיינות אינטראקציות חלבונים בתוך כלורופלסטים. חוקרים מאוניברסיטת אוקספורד מתארים שיטה במבחנה המשתמשת בכלורופלסטים מבודדים, המודגרים בחלבונים מסומנים רדיואקטיביים כדי לעקוב אחרי קליטם.
שיטה זו היא פיתוח של גישות קודמות ששימשו לחקר ייבוא חלבון כלורופלסט במבחנה. לאחר מכן, בשיטה משלימה, ייבוא חלבון כלורופלסט נבדק ב-vivo. שיטה זו עושה שימוש בביטוי חולף של חלבונים כימריים ופרוטופלסטים כדי לבחון שינויים בגודל חלבונים ומיקום באמצעות מיקרוסקופיה של אימונובלוטינג ופלואורסצנציה.
בסרטון השיטה הזה, המחברים בחנו את מערכת הממברנה התילקואידית הנמצאת בכלורופלסטים. על ידי בידוד הממברנות, מסלולי העברת החלבונים מתבהרים בכלורופלסטים באמצעות SDS-PAGE ודימות זרחן. חוקרים בצרפת מיישמים שיטות צנטריפוגציה שונות כדי לבודד את תת-התאים שנמצאים בכלורופלסטים.
החלקים התאיים המבודדים הללו מנותחים לאחר מכן באמצעות אימונובלוטינג ופרוטאומיקה כדי לספק מידע על מיקום תת-אברוני חלבוני כלורופלסטים. לאחר מכן, חוקרים שווייצרים השתמשו בטיהור זיקה של קומפלקסים רב-חלבונים של כלורופלסטים כדי לבחון את המנגנון המולקולרי המעורב בייבוא חלבונים. במיוחד קומפלקסים רב-חלבוני של דיבור וקרציות המוטמעים בממברנות מעטפת.
בגישה משלימה, מדענים מאפיינים את קומפלקס החלבון תילקואיד הצמחוני ב-Arabidopsis באמצעות Blue Native PAGE, או BN-PAGE, שמאפשר הפרדה של קומפלקסים חלבונים בצורתם הטבעית והפונקציונלית. הקומפלקסים מנותחים בהמשך באמצעות SDS-PAGE דו-ממדי. הרגע קיבלתם הצצה לשיטות השונות שבהן נעשה שימוש לחקר חלבוני כלורופלסטים באוסף שיטות JoVE שלנו.
ניתן לצפות במאמרים לעומק בדף האינטרנט של אוסף שיטות המחקר של כלורופלסטים המוצג בקישור שעל המסך.
סקירה כללית
אוסף שיטות JoVE זה בנושא שיטות מחקר של כלורופלסטים מציג סט מקיף של טכניקות משלימות in vitro ו-in vivo לחקר ייבוא חלבונים לכלורופלסט, לוקליזציה, פרקציונציה סוב-אורגנלית ואינטראקציות בין חלבונים. האוסף מתמקד בצמח המודל Arabidopsis thaliana אך ניתן להתאימו לאורגניזמים אחרים. השיטות כוללות בדיקות של מקדימים (precursors) המסומנים רדיואקטיבית, מעקב אחר חלבונים כימריים פלואורסצנטיים, מחקרי טרנסלוקציה של תילקואידים, פרקציונציה סוב-צלולרית, טיהור באמצעות זיקה (TAP-tag), ו-native PAGE (BN-PAGE) לניתוח קומפלקסים. גישות אלו מאפשרות חקירה מפורטת של הביוגנזה והתפקוד של הכלורופלסט, ובמיוחד של הפרוטאום האורגנלי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה של תאי צמחים
- ביוגנזה של כלורופלסטים
- ניתוב וייבוא של חלבונים
רקע
- כלורופלסטים הם אברונים חיוניים האחראים על פוטוסינתזה ועל תפקודי מטבוליזם רבים בצמחים.
- מרבית החלבונים של הכלורופלסט מקודדים בגרעין ודורשים ייבוא דרך מעטפת הכפולה.
- הבנת התargeting של חלבונים, מיקומם ואינטראקציות ביניהם היא קריטית לקידום מניפולציות בכלורופלסטים בביוטכנולוגיה הקשורה לביטחון תזונתי ולאנרגיה ביולוגית.
מטרת המחקר
- מתן סט של טכניקות משלימות לניתוח ייבוא ומיקום של חלבוני כלורופלסטים.
- מתן אפשרות לחקר מסלולי מיון פנימיים, כולל תיווך לממברנת הילקואיד.
- סיוע באפיון של קומפלקסים רב-חלבוניים של כלורופלסטים, כגון TOC ו-TIC.
- תמיכה באסטרטגיות ביוטכנולוגיות שמטרתן לשפר את פריון הצמחים ואת עמידותם לעקה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בדיקת ייבוא in vitro באמצעות כלורופלסטים מבודדים וחלבונים מקדימים המסומנים רדיואקטיבית, עם SDS-PAGE ודימוי זרחתי (phosphor-imaging).
- בדיקת ייבוא in vivo באמצעות ביטוי זמני של חלבונים מקדימים כימריים פלואורסצנטיים בפרוטופלסטים, בניטור באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה ו-immunoblotting.
- מחקרי טרנסלוקציה של חלבוני תילקואיד באמצעות תילקואידים מבודדים, חלבונים מקדימים המסומנים רדיואקטיבית, תמצית סטרומה ובדיקות הגנה מפני פרוטאז.
- סב-פרקציונציה של כלורופלסטים למעטפת, סטרומה ופרקציוני תילקואיד באמצעות סנטריפוגציה לצורך immunoblotting ומספקטרומטריית מסות.
- טיהור זיקה (TAP-tag) של קומפלקסים רב-חלבונים של כלורופלסטים מצמחים טרנסגניים.
- BN-PAGE (Blue Native PAGE) ולאחריו 2D SDS-PAGE להפרדה במצב טבעי (native) ורזולוציה דנטורטיבית של קומפלקסים פוטוסינתטיים.
תוצאות עיקריות
- בדיקת ייבוא in vitro מאפשרת להעריך את שסועו של פפטיד המעבר ואת תגובת מערכת הייבוא למעמדים של עקה (stress).
- בדיקה in vivo מאפשרת מעקב סימולטני אחר לוקליזציה ועיבוד של חלבונים באמצעות פלואורסצנציה ו-immunoblotting.
- נתיבי התעתוק לתילקואיד מבודלים על ידי מדידת שסועו של פפטיד האות והגנה מפני פרוטאזות.
- סוב-פרקציונציה (Subfractionation) מניבה תאי קומפרטמנטים של כלורופלסטיים בדרגת טהרה גבוהה לצורך אנליזה פרוטאומיקה מפורטת.
- טיהור באמצעות TAP-tag מאפשר בידוד של מערכת הייבוא TOC/TIC ושל קומפלקסים אחרים.
- BN-PAGE מאפשרת ויזואליזציה של קומפלקסים חלבוניים במצבם הטבעי (native), אותם ניתן לנתח בהמשך באמצעות 2D SDS-PAGE.
מסקנות
- השיטות המשולבות מציעות ארגז כלים רב-עוצמה לניתוח הביוגנזה והתפקוד של חלבונים בכלורופלסט.
- טכניקות אלו הן משלימות וניתן להשתמש בהן במקביל כדי לתקף ממצאים במערכות ניסוייות שונות.
- ניתן להתאים את הגישות הללו מעבר ל-Arabidopsis למינים של צמחים ולאבנים אחרים.
- קידום הידע על הפרוטאומיקה של הכלורופלסט תומך במאמצים גלובליים בתחומי החקלאות, הביו-אנרגיה ועמידות לעקה.
שאלות נשאלות שכיחוק
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מחקרים על תגיתיב (targeting), לוקליזציה ואינטראקציה של חלבונים בכלורופלסט הם קריטיים לקידום הביוטכנולוגיה של צמחים, ובמיוחד לאופטימיזציה של יעילות הפוטוסינתזה והעמידות לעקה. שיטות אלו מאפשרות הפחתת סיכונים מכניסטית וביטחון חיזוי בשלב הגילוי, ובכך תומכות ברציפות תרגומית מתובנות מולקולריות ועד לחדשנות חקלאית יישומית. שילוב טכניקות אלו בצינורות המו"פ משפר את קבלת ההחלטות לגבי תיקי פיתוח לשיפור גידולים ויוזמות אנרגיה ביולוגית.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של מסלולי ייבוא חלבונים ומנגנוני תגית לתתי-אברונים.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של חלבונים מועמדים המעורבים בביוגנזה של כלורופלסטים ובתגובה למעמט.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבהרת לוקליזציית חלבונים ורשתות אינטראקציה.
- משפר את הביטחון החזוי בבחירת מטרות בעלות פוטנציאל תרגומי במערכות צמחים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכות validated in vitro ו-in vivo להערכה כמותית של ייבוא ועיבוד חלבונים.
- מסטנדרט את תנאי הבדיקה למדידה ניתנת לשחזור של לוקליזציה של חלבונים והרכבת קומפלקסים.
- מאפשר סריקה בקנה מידה רחב (scalable) של מודולטורים גנטיים או כימיים המשפיעים על מסלולי חלבונים בכלורופלסט.
- תומך בהערכה אמינה של התערבויות מועמדות במערכות צמחים של מודל ובמערכות יישומיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מבצע התאמה בין נתוני לוקליזציה ואינטראקציה של חלבונים לבין סמנים ביולוגיים תרגומיים לצורך פיתוח תכונות של גידולים חקלאיים.
- מבטיח רציפות מגילוי מולקולרי ועד לתיקוף פרה-קליני בקווי ייצור של ביוטכנולוגיה של צמחים.
- מפחית את הסיכונים בקבלת החלטות על קידום השלב הבא על ידי אספקת ראיות תאיות-תת-סלולריות ופרוטאומיות חסונות.
- מאפשר התאמה של הממצאים למיני צמחים מגוונים ולהקשרים חקלאיים שונים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטות מחקר אלו של כלורופלסטים משולבות לאורך רצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ראשונית ותיקוף מטרות ועד לפיתוח תכונות פרה-קליניות בביוטכנולוגיה של צמחים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בניתוח מונחה-השערה של ייבוא חלבונים, לוקליזציה ואינטראקציה בתוך כלורופלסטים.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור עבור בדיקות של תגית חלבונים והרכבת קומפלקסים.
- אנליטיקה: מספק קריאות אמינות באמצעות SDS-PAGE, אימונו-בלאט (immunoblotting), מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ומספקטרומטריית מסות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים מולקולריים לפיתוח תכונות ועמידות לעקה בגידולים חקלאיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פרוטוקולים ניתנים להתאמה עבור מודלים צמחיים מגוונים ויישומים בביוטכנולוגיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון במיקוד החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר חלבוני הכלורופלסט.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של בדיקות ייבוא ומיקום של חלבונים.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס לקבלת החלטות לגבי המשך ביצוע (go/no-go) והקצאת הון עבור פרויקטים לשיפור גידולים וביו-אנרגיה.
- השפעה על פורט폴יו: מאפשר תיעדוף של מטרות וטכנולוגיות בקווי הפיתוח של הביוטכנולוגיה הצמחית, בהתאמה לרמת הסיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה מולקולרית של צמחים, ביוכימיה של חלבונים, ודימוי מתקדם או פרוטאומיקה.
- מחייב גישה למכשור ייעודי כגון מיקרוסקופי פלואורסצנציה, צנטריפוגות ומספקטרומטרי מסה.
- מצריך סטנדרטיזציה של פרוטוקולים בין צוותים לצורך הדירות (reproducibility) בין מעבדות ופרויקטים.
- הפרוטוקולים ניתנים להתאמה אך עשויים לדרוש אופטימיזציה עבור מיני צמחים שונים או מערכות אורגנלה שונות.
- המגבלות כוללות את הצורך בהכנות אורגנלה באיכות גבוהה ושונות פוטנציאלית במערכות ביטוי in vivo.
