הרכבה ותפעול של מכשיר אצוטופלואידי לאספקה משופרת של תרכובות מולקולריות לתאים

פרוטוקול זה מתאר את ההרכבה וההפעלה של מערכת אצוטופלוידית שיכולה לספק ביעילות ביומולקולים למגוון יישומים טיפוליים מבוססי תאים ומחקר. היתרון העיקרי של מערכת זו הוא שהיא מאפשרת אספקה מהירה של ביומולקולים לתאים תוך שמירה על הכדאיות שלהם. זוהי טכנולוגיית פלטפורמה המאפשרת לתאים להשתנות עבור מגוון יישומים טיפוליים תאיים, כגון טיפול בסרטן.

התחל על ידי שילוב של 54 גרם של בסיס PDMS ושישה גרם של חומר ריפוי בכוס. מערבבים במרץ וביסודיות עם מרית במשך דקה אחת לפחות, ולאחר מכן מניחים את הכוס עם פתרון PDMS לתוך ייבשן במשך כ 30 דקות או עד בועות אוויר שריד מוסרים. מניחים רקיק מצופה פוטורסיסט עם התבניות הפונות כלפי מעלה בצלחת פטרי 150 מ"מ, ולאחר מכן יוצקים את תמיסת PDMS על התבנית.

במידת הצורך, מניחים את צלחת הפטרי בתוך חיטוי ומחילים ואקום עד שבועות האוויר השרידיות נעלמות. מעבירים את צלחת הפטרי לתנור מעבדה ואופים במשך שעתיים ב-60 מעלות צלזיוס כדי לרפא את ה-PDMS. לאחר הריפוי, יש להסיר בזהירות את ה-PDMS מצלחת הפטרי על ידי חיתוך בשולי הוופל עם סכין גילוח.

חותכים כל מכשיר בודד באמצעות סכין או סכין גילוח, ולאחר מכן ניקוב חורים דרך יציאות המפרצון והשקע באמצעות אגרוף ביופסיה 2.5 מ"מ. לאחר טיפול בהתקן PDMS עם פלזמת חמצן, יש להניח מיד כל מכשיר על שקופית מיקרוסקופ זכוכית סודה ליים נקייה עם ערוצים הפונים למשטח הזכוכית. אפשר למכשירים להתחבר למשך הלילה בטמפרטורת החדר.

יש למרוח בעדינות סיליקון על פני השטח של מתמר פיזו בקוטר סנטימטר אחד בעובי של מילימטר אחד עד שני מילימטרים, ואז מיושר בזהירות את המתמר עם ספירלה קונצנטרית ולחץ אותו בעדינות על החלק התחתון של שקופית מיקרוסקופ הזכוכית. חבר מיקרו-בקר למחשב באמצעות כבל USB A עד B. מחווני LED בעוצמה ירוקה אמורים להאיר.

השתמש בתוכנה המשויכת במחשב כדי להעלות תוכנית שמייצרת אות שמונה מגה-הרץ. הלחמה חוט 22 מד אינץ 'עד סוף כל חוט על מתמר PZT. לאחר מכן השתמש בו כדי לחבר את חוט המסוף השלילי של מתמר PZT לפין GND.

חבר את חוט המסוף החיובי של מתמר PZT לפין היציאה באמצעות החוט המולחם. חותכים שלושה עד שישה אינץ ' קטעים של צינורות פלסטיק רך Tygon PVC ולדחוף את הצינורות לתוך הכניסה ויציאות שקע. ייתכן שיהיה צורך לסובב את הצינורות תוך הפעלת לחץ עד שהוא מתאים לפתיחה.

לחלופין, ניתן להחיל דבק בצומת כדי לחבר את ה- PDMS והצינורות יחד. לחלופין, התקן את ההתקן האצוטופלואידי ואת המיקרו-בקר במארז מודפס בתלת-ממד. להרכיב את המאגר microfluidic על פי הוראות היצרן.

חותכים קטע של 3 עד 6 אינץ' של צינורות פלסטיק רכים מסוג טייגון PVC בקוטר פנימי בקוטר 1/16 אינץ' ודוחפים אותו מעל הצינורות בקוטר הפנימי של 1/32 אינץ' מתפוקת המאגר המיקרופלואידי. לחלופין, לעטוף את הצומת עם סרט פרפין כדי למנוע דליפה. מלא מזרק 60 מיליליטר עם אוויר הסביבה בצד של המאגר microfluidic.

הגדר את משאבת המזרק לקצב של 200 מיליליטר לשעה כדי לדחוף את פתרונות סוכן הניגוד דרך המכשיר acoustofluidic בקצב זרימה נפחית של 50 מיליליטר לשעה ולאסוף את הדגימות מן הפלט של המכשיר לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר. הכן פתרון phopholipid ב 20 מיליליטר נוצץ במין על ידי הוספת 25 מיליגרם של DSPC, 11.6 מיליגרם של DSEPC, 0.26 מיליגרם של DSPG, ו 0.88 מיליגרם של פוליאוקסיאתילן40 סטארט. מוסיפים כלורופורם עד שכל הפוספוליפידים מתמוססים.

לאדות כלורופורם בייבוש במשך 48 שעות כדי ליצור סרט שומנים יבש. Rehydrate הקצף עם 10 מיליליטר של PBS סטרילי, ולאחר מכן sonicate פתרון השומנים במשך שלוש דקות ב 40%משרעת כדי ליצור פתרון מיסלרי קטי. לאחר sonication, הפתרון phopholipid ניתן לאחסן בשתיים עד שש מעלות צלזיוס עד חודש אחד.

כדי להכין סוכני ניגודיות אולטרסאונד, להוסיף 200 microliters של פתרון מיסלר קטי ב 600 microliters של PBS סטרילי ל בקבוקון מחיצה זכוכית שני מיליליטר. אוטמים את הקרבון על ידי קיצור הכובע. השתמש במחט 1.5 אינץ '20 מד כדי למלא את שטח ראש הוויאלי עם גז decafluorobutane במשך 30 שניות.

Amalgamate את הנקניקיון כדי ליצור סוכני ניגודיות אולטרסאונד מלא גז perfluorobutane. הוסף 25 microliters של פתרון סוכן ניגודיות אולטרסאונד לכל מיליליטר אחד של פתרון התא. לאחר מכן מיד לשאוב את סוכן הניגוד המשולב תערובת התא דרך המכשיר acoustofluidic.

פרוטוקול זה מייצר מערכת אצוטופלוידית שניתן להשתמש בה כדי לשפר את המסירה המולקולרית התארית בקווי תאים מרובים. משלוח תאי של תרכובת פלואורסצנטית, פלואורסצ'ין, לתאי T אנושיים ראשוניים שופרה עם טיפול אצוטופלואידי בהשוואה לקבוצת ביקורת לא מטופלת. עוצמת הפלואורסצנטיות של תאי T גדלה פי חמישה לאחר הטיפול, מה שמצביע על משלוח משופר של פלואורסצין.

הכדאיות התאית ירדה מעט לאחר טיפול אצוטופלואידי, אך נשארה מעל 80%טיפול Acoustofluidic משופרת משלוח תאי של טרהלוז תרכובת משמרת לתאי קרצינומה ריאות A549 אנושיים בהשוואה לזרימה לבד ולתאים בקבוצת הביקורת הלא מטופלת. הוספת המיקרו-יבלים הקטיוניים לפתרון התא היא קריטית. אספקה תאית של ביומולקולים תוגבל ללא מיקרו-יבלות קטיקטיות בתמיסה.

פלטפורמה זו מאפשרת אספקה תאית של ביומולקולים שונים, אשר יכול לשנות את התפקוד התאי למטרות מחקר או טיפוליות. לאחר השלמת הליך זה, ניתן לבצע אפיון תאי נוסף כדי להעריך את ההשפעה של אספקת biomolecules שונים.