מכשיר microfluidic עם דפוסי Groove לחקר התנהגות נייד

שמי ג'יאנג, אני עמית פוסטר מהרווארד ו-MIT, בתחומי הבריאות, המדע והטכנולוגיה. המומחיות שלי במעבדה זו היא פיתוח מכשירי מיקרופלואידיקה חדשניים לחקר התנהגות תאית. אני יכול לפתח מכשירי מדרג (gradient devices) חדשניים, וכן לשלב ביניהם לבין מכשירי מיקרופלואידיקה.

מכשיר ה-TC יכול להפעיל מניפולציה מדויקת על אינטראקציה בין תא לתא ועל אינטראקציית תאים, כמו גם על מגע עם גורמים סולאריים של התא. לכן, באמצעות מערכת ה-TC אני יכול לחקור כדי להבין את הביולוגיה הבסיסית של התא, וכן ליישם עקרונות של ביולוגיה התפתחותית ושל הנדסת ביו-תאי גזע. שמי אמיר מנצ'י ואני סטודנט לתואר ראשון במעבדה של פרופסור האן ב-Harvard, MIT Division of Health Sciences and Technology.

עבדתי על התקני מיקרופלואידיקה וניסינו, כהוכחה לעקרון, להראות שהתקני מיקרופלואידיקה הם התקנים בעלי פוטנציאל רב לתרבית תאים ולביצוע מחקרים שונים, כגון מחקרי רעילות, וכן ניסינו לחקור ולבצע אופטימיזציה של אפיון הזרימה בתוך התקנים אלה כפונקציה של קצבי זרימה, גיאומטריה ופרמטרים שונים אחרים. כעת אנו מתחילים בחדר המיקרו-פבריקציה ומה שאנחנו עומדים לעשות הוא לנסות לייצר מספר התקני מיקרופלואידיקה; כדי לייצר את התקני המיקרופלואידיקה אנו זקוקים לתבניות על גבי פרוסות סיליקון ולתבניות PDMS מעליהן. פולימר ה-PDMS הוא למעשה תערובת של שני מרכיבים שונים.

זוהי תערובת של בסיס אלסטומר סיליקון וסוכן הקשחה של אלסטומר סיליקון. אופן הערבוב של השניים הוא ביחס של 10 ל-1, כלומר 10 יחידות בסיס ויחידה אחת של סוכן הקשחה. כעת אני זקוק לכ-20 gram של הבסיס שלי כאן.

אני זקוק גם לשני גרם של חומר המקשה, וחומר המקשה הוא פחות צפוף באופן משמעותי. הוא יזרום הרבה יותר מהר ואני צריך להיות מעט זהיר. כעת הטמפרטורה היא כ-22 מעלות ואני רוצה לערבב את הבסיס ואת חומר המקשה יחד.

לכן אשתמש בפיפטה כדי לבצע זאת. אנסה לערבב את המרכיבים יחד בצורה הטובה ביותר האפשרית. אני רוצה למזוג את פולימר ה-PDMS על גבי פרוסות הסיליקון שעל גבן קיים תבנית, כאשר פרוסות הסיליקון מסייעות ביצירת התבנית עבור תבניות ה-PDMS.

ניתן להבחין כי יש לי כאן שתי פרוסות סיליקון, והסיבה לכך היא שאחת מהן מיועדת לשכבה העליונה של התקן המיקרופלואידי שלנו והשנייה מיועדת לשכבה התחתונה. אנו זקוקים לשתי שכבות בהתקנים מיקרופלואידיים כיוון שאנו שואפים ליצור תעלה בפנים, והעיקרון שעומד מאחורי התקנים המיקרופלואידיים הוא הרצון להשיג זרימה בתוך התעלות הללו. לכן, עליי לשפוך את התערובת הזו על גבי שתי פרוסות הסיליקון, כיוון שישנן בועות רבות בתוך התערובת.

אני רוצה להוציא את הבועות הללו, ולשם כך נשתמש בואקום כדי להוציא אותן. חזרנו לאזור המעבדה הראשי, וכפי שאמרתי קודם לכן, מכיוון שבתוך תערובת ה-PDMS ישנן בועות רבות ואנו רוצים להסיר אותן, אני אניח את התערובות על גבי פרוסות הסיליקון (silicon wafers) בתוך תא הוואקום. אני אסגור את התא ואפעיל את הוואקום. לאחר מכן, נכניס את תבניות ה-PDMS לתנור למשך הלילה כדי להפוך אותן למוצקות יותר.

בסדר, אנחנו נמצאים כעת במעבדה ואנו רוצים להרכיב את התקני המיקרופלואידקה הללו. מה שנעשה הוא ניקח את תבניות ה-PDMS, שהיו בתוך האינקובטור במהלך הלילה ובהן נוצרו התבניות שהיו על פרוסות הסיליקון, ואני אשתמש בשתי תבניות שונות. בצד שמאל ניתן לראות את המיקרו-תעלה, שתהווה את השכבה העליונה, ובצד ימין ניתן לראות תבניות של קווים ירוקים שיהוו את השכבה התחתונה.

וזה, זה שיצור את החריצים בתוך המיקרו-התקן. אני מתחיל בחיתוך הג'לים הללו כדי שהשכבה העליונה תוכל להיפרד בקלות מהפרוסת הסיליקון. מה שאעשה הוא להעביר אותם למנתרא פטרי כשהם פונים כלפי מעלה, כך שהתבניות יפנו למעלה.

ואנסה לעשות את אותו הדבר עבור החריצים, שהיו תבניות הקווים הירוקים. אלו יהוו את השכבה התחתונה. לאחר חיתוך הג'ל, אעביר אותו לפטריית פטרי, וכדי למנוע הצטברות אבק מעל התבניות, אדביק אותן בסרט דביק.

השלב הבא הוא ניקוב קצות התעלות כדי לאפשר לתאים ולתווך לזרום פנימה והחוצה. מכיוון שיש לי כאן שטח פנים רחב ואיני יכול לראות את התבניות בעצמי, אשתמש בכלי זה כדי שאוכל לראות את התעלות ואנקב את שני הקצוות. אנקב חור גדול כאן כדי שיהיה מרווח רזרבי, ובצד השני אנקב חור קטן כדי שניתן יהיה להשתמש בצינורות poly ethanol בצד השני.

אנו נמצאים כעת בחדר המיקרו-פבריקציה, והשלב הבא הוא לחבר את שני המשטחים השונים שבידינו. כדי לעשות זאת, נשתמש במכשיר זה הנקרא מנקה פלזמה (plasma cleaner), והתהליך נקרא טיפול בפלזמה. בתוך התא נוצר סביבת פלזמה, ובמהלך האינטראקציה של הפלזמה עם המשטח, הפלזמה תפרק את הקשרים החלשים על פני השטח ותחליף אותם בקבוצות כימיות בעלות תגובתיות גבוהה.

כעת אסיר את הסרטיים שהוצמדו כאן כדי למנוע חדירת אבק, ואני אכניס את התבניות הללו לתוך התא. אני אסגור את הדלת הזו עד הסוף, אפעיל תחילה את החשמל ולאחר מכן את המשאבה, ואז נהיה מוכנים להתחיל. נחזור לכאן בעוד חמש עד 10 דקות.

כעת אני רוצה לכבות את המערכת, לכן אכבה את המשאבה ואת החשמל, ולאחר מכן אפתח את התא. למעשה, יש כאן לחץ שלילי, לכן ייתכן שתשמעו רעש. זה קורה בגלל הלחץ השלילי, לכן אני מוציא את התבניות שלי לאט.

מכיוון ששני משטחי התבניות פונים כלפי מעלה, אקח את השכבה התחתונה, אניח אותה בידי השמאלית, ואקח את השכבה העליונה, אהפוך אותה ואניח אותה מעל החריצים שלי, ולאחר מכן אלחץ את השכבות זו על זו. חוזק ההדבקה והעמידות הם היתרון בשימוש במכונת טיפול הפלסמה הזו. ומה שאתם רואים כאן כעת הוא שניתן לראות למעשה את התעלה בשכבה העליונה ואת תבניות החריצים בשכבה התחתונה, וזה מוכן להמשך לשלב הבא.

לאחר מכן, הבא לכאן את חדר התרבית, את מצע הגידול ופתח את המכסה של הצלחת. כעת ניתן להטעין את ה-fibronectin; שאיפה של 60 µL של fibronectin והעברתו אל תוך המכשיר. כדי ליצור זרימה בתוך המכשיר שתגרום לציפוי דק של ה-fibronectin בתוך התעלה, ניתן לבצע שאיבה עדינה מהפתח של היציאה.

לאחר מכן ניתן להניח את המכשיר בתוך האינקובטור למשך שעה אחת. לאחר שעת קירור תוך כדי רעידה בתוך האינקובטור, נוציא את הדגימה מהאינקובטור ולאחר מכן נשתמש בשלוש מברשות סיבים. נבצע השחלה ושטיפה, ולאחר מכן נוסיף את המצע, וסוף סוף נספור את התאים באמצעות מונה תאים.

בדרך כלל אנו שואפים שמיליון תאים יהיו בתוך המכשיר. לכן, לאחר הדיסוציאציה, ניתן פשוט לדחוף את התמיסות מספר פעמים, להוציא את תרחיף התאים ולאחר מכן להטעין אותם לתוך התעלה. כדי להטעין את התאים לתוך התעלה בצורה טובה יותר, ניתן להזרים אותם בעדינות באמצעות שאיבה.

שואבים את מצע העל והסספנזיה מהפנימה דרך תא היציאה, בדרך כלל באופן אוטומטי, כדי לזרוע את התאים בערוץ הגלובלי הסלקטיבי. לאחר מכן ניתן לפרק את המערכת ולהניח אותה באינקובטור למשך שעה אחת, עד שהתאים יתפרסו לחלוטין בתוך הערוץ. לאחר מכן ניתן להזרים annexin V ו-propidium iodide, וכן hydrogen peroxide.

לאחר מכן, בצעו את בדיקת היפותזת הזמן. ניתן לקחת את הדגימה בתוך מצע לתרבית רקמות, ואז להכין תמיסה המכילה 2 mL מתווך DMEM, וכן 20 µL של Annexin V, 40 µL של Propidium Iodide ו-100 mL של Hydrogen Peroxide. לאחר מכן, קחו את ה-2 mL של המתווך עם Annexin V, Propidium Iodide ו-Hydrogen Peroxide, והעבירו אותם למזרק.

הכנס את שני סמילי-מדיה ואת annex five prop iodide, hydro perside. ניתן פשוט להכניס את התמיסה לתוך ה-ceilings, להסיר את הבועה ולאחר מכן לחבר את ה-C bear. אלו הם ה-Hamilton warm mill ceilings אטומים לגז.

זהו דוב שלוש. אלה הם תקרות רב-פעמיות. זוהי מחט בכיול 27 gauge.

זוהי צינורית פוליאתילן (PE) בעלת קוטר 20. לאחר טעינת התמיסה לתוך מזרק, ניתן פשוט לדחוף את התמיסה באופן מלא מספר פעמים, ולעיתים להקיש קלות על המזרק כדי להוציא את בועות האוויר ולמשוך את התמיסה. פעם נוספת, דחפו את התמיסה באופן מלא, הוציאו את בועות האוויר ואז שאיפו בעדינות שוב.

כעת ניקח את התמיסה עבור מנה אחת ולאחר מכן נוכל להעביר את השסתום. נדחף את התמיסה דרך השסתום התלת-כיווני לתוך הפואובולה. לבסוף, התמיסה תצא דרך קצה הפואובולה, ואז נוכל פשוט לחבר את הפואובולה להתקן המיקרו ולהתחיל להזרים 1 µL לדקה.