לוחץ תא כחזק, Microfluidic תאית פלטפורמה להצגה
7 בנובמבר 2013
עיוות מכאנית מהירה של תאים התפתחה שיטה למסירה תאית של מקרומולקולות וננו מבטיחה, ללא וקטור. פרוטוקול זה מספק שלבים מפורטים כיצד להשתמש במערכת עבור מגוון רחב של יישומים.
המטרה הכוללת של ניסוי הנפילה היא לספק מקרומולקולות חופשיות לתאי מטרה באמצעות שיבוש מכני. זה מושג על ידי הצבת סוג תא המטרה תחילה בתרחיף עם חומר האספקה הרצוי והעמסה למאגר של מכשיר מיקרופלואידית שתוכנן במיוחד. כשלב שני, המכשיר המיקרופלואידי מופעל בלחץ והתאים מונעים דרך מערך של תעלות מיקרופלואידיות הסוחטות את התאים כדי להקל על שיבוש הממברנה החולפת.
לאחר מכן, התאים מורשים לדגור בנוכחות חומר אספקת המטרה כדי להקל על הובלה דיפוזית של החומר לציטופלזמה של התא. בזמן תיקון קרום התא. מתקבלות תוצאות המראות אספקה יעילה של מקרומולקולות באמצעות ציטומטריית זרימה.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו ATION ושלמות ליפו, הוא שהיא מסוגלת לטפל בסוגי תאים וחומרים מאתגרים שלא ניתן להעביר ביעילות בשיטות אחרות. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגי, כגון כיצד לשפר את תכנות התאים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הטיפול והאבחון של סרטן מכיוון שהמערכת מאפשרת מניפולציה של תאי חיסון כדי לשפר את יעילותם האנטי-גידולית.
כדי להתחיל, יש לייצר או לרכוש את המכשיר המיקרופלואידי, מחזיק המכשיר, מאגרי נוזלי הפלסטיק וטבעות ה-O המוצגים כאן ומפורטים עם פרטים בפרוטוקול הטקסט הנלווה, ולאחר מכן מלאו שלושה מיכלים הניתנים לאטימה חלקית באתנול 70%. מניחים את המכשירים במיכל הראשון, את המאגרים וטבעות ה- O במיכל השני ומחזיקים בשלישי. לאחר מכן מלאו את המכולות עד הסוף באתנול של 70%.
במקום הבא, המיכל המכיל את המאגרים וטבעות ה-O וכן זה המכיל את המחזיקים באמבט אולטרסאונד למשך חמש עד 10 דקות לפני השימוש. זה יעזור להסיר חלקיקים מזהמים מניסויים קודמים בזמן שהרכיב סוניקט מנגב את סביבת העבודה בארון בטיחות ביולוגית עם 70% אתנול. לאחר מכן עקר את כל החומרים הנדרשים כולל שלושת המיכלים וזוג פינצטה על ידי ניגובם באתנול 70% והנח אותם בתוך ארון הבטיחות הביולוגית כדי להתחיל בהרכבה.
ראשית, הניחו שניים עד שלושה מגבוני מוך נמוכים באזור העבודה. לאחר מכן הסר את מאגרי הפלסטיק ממיכל האתנול בעזרת פינצטה והניח אותם על המגבונים כדי להקל על נידוף ואידוי אתנול מהמשטח הפנימי שלו. הקש בעדינות על המאגרים כדי לסייע בהסרת תמיסת האתנול.
במידת הצורך, השתמש בגז בלחץ כדי לטהר את המאגר במלואו. לאחר שהמאגרים התייבשו, הכנס את טבעות ה-O לחריצים המתאימים במאגרים. לאחר מכן השתמש בפינצטה כדי למקם את השבב עם הפנים כלפי מעלה במחזיק המכשיר.
ודא שהשבב מונח שטוח במחזיק והתאם במידת הצורך באמצעות הפינצטה. אם המכשיר אינו מתאים כראוי למחזיק שלו, קיים סיכון שהוא יישבר במהלך השלבים הבאים. לאחר מכן, הנח בעדינות את המאגרים על המחזיק ויישר אותם עם הקליפים.
ודא שטבעות ה-O לא נופלות מהחריצים שלהן. במהלך תהליך זה, לחץ בעדינות על המאגרים עד שהם ייכנסו למקומם בנקישה. ודא ששני צידי המאגרים מאובטחים ושהשבב נראה במצב הנכון.
אל תלחץ על המאגרים בכוח מופרז. מכיוון שהלחץ עלול לשבור את השבבים לראשוני או הדבקות. קווי תאים, מקמו תאים יום עד יומיים לפני הניסוי כך שהם לא יהיו יותר מ-80% מתלכדים.
ביום הניסוי. מיד לפני הניסוי, קצרו את התאים והחזירו אותם, השעו אותם במדיה או במאגר רצוי אחר בין 1 ל-10 מיליון תאים למיליליטר. לאחר מכן העבירו בזהירות את תרחיף התאים דרך רשת מסננת תאים של 40 מיקרון כדי למנוע מגושי תאים ומטריצה לסתום את המכשיר.
לאחר הסינון, ערבב 300 מיקרוליטר של תרחיף התא עם הריכוז הרצוי של חומר האספקה בצינור נפרד. להדגמה זו, שני מיקרוליטר דקסטרין בחמישה מיליגרם למיליליטר ושני מיקרוליטר אלקסה. 4 88 נוגדנים לבקרת איזוטופים מתווספים לכל 50 מיקרוליטר של תרחיף תאים.
לאחר מכן, מערבבים בעדינות 100 מיקרוליטר מהתאים על ידי פיפטינג. לאחר מכן בעזרת קצות העמסת ג'ל, פיפטה את התאים וחומר האספקה לאחד מהמאגרים, חבר צינורות לחץ למאגר המלא והדק את הקשר באצבע כדי להבטיח תקרה נכונה. לאחר מכן כוונן את לחץ האוויר ל-70 PSI בווסת כדי לשלוט במהירות שבה התאים נעים דרך המכשיר.
יש לבצע אופטימיזציה של הלחץ עבור שילוב התא והשבב המיקרופלואידי הספציפי המשמש בכל ניסוי. כשהכל מוכן, הרם את המכשיר לגובה העיניים וכוון אותו כך שהנוזל במאגר נראה בקלות. לאחר מכן לחץ על שסתום הכפתור כדי ללחוץ על המאגר ולהתחיל בזרימת התאים.
צפו במהירות שבה הנוזל זורם מהמאגר. אם הנוזל מאט באופן משמעותי ביחס לקצב הזרימה הראשוני שלו, סביר להניח שהמכשיר המותקן סתום ויש להחליפו. הגזירה המוגברת הנגרמת על ידי החסימה תגרום למוות תאים גדול מהרגיל.
כאשר מפלס הנוזל הוא כשני מילימטרים מתחתית המאגר, סובב במהירות את הרגולטור לאפס PSI כדי לעצור את הזרימה. חשוב לעצור את זרימת האוויר לפני ריקון המאגר, אחרת הדגימה עלולה להיפלט ממאגר האיסוף. לאחר מכן אוספים את התאים המטופלים ממאגר הזרימה ומניחים אותם בצינור מיקרו צנטריפוגה.
בטמפרטורת החדר, התאים המדורגים ימשיכו לספוג חומר עד 10 דקות. לאחר 10 דקות, צלחו את התאים במדיה נוספת או המשיכו להשתמש בתאים בהתאם לצרכי הניסוי. חזור על שלבים אלה כדי לאסוף כמה שיותר תאים מטופלים ולהחליף את השבבים לפי הצורך אם הם סותמים ומשליכים את המכשירים הסתומים C עבור כל דגימה עוקבת.
שנה את כיוון הזרימה כדי למזער את השפעות הסתימה. בסיום איסוף התאים, נתק בעדינות את המאגרים מהמחזיק הראשי על ידי דחיפת זרועות הקליפ הצידה. לאחר מכן הניחו כל חלק לשימוש חוזר במיכל האחסון המתאים ומלאו אותם באתנול טרי של 70%.
לבסוף הניחו את כל השבבים המשומשים בכלי נפרד לסילוק נאות. יעילות המסירה וכדאיות התאים של תאי הלה נמדדו. לאחר סדרת ניסויים, נבדקו שלושה שבבים מיקרופלואידיים שונים בטווח מהירויות של עד 600 מילימטרים לשנייה.
בדיקות אלה הראו כי מהירויות זרימה מוגברות שיפרו את האספקה של דקסטרין מצומד פלואורסצנטי של שלושה קילודלטון לתאים עבור כל אחד מהשבבים שנבדקו. בנוסף, מהירויות מוגברות גרמו גם לירידה של כ-20% בכדאיות התאים במכשירים שנבדקו. כמות זו של מוות תאים נמוכה יחסית ולעתים קרובות גבוהה בהרבה במכשירים שתוכננו בצורה לא מתאימה.
הספיגה של דקסטרין מצומד כחול פסיפי לאוכלוסיית תאי הביקורת המוצגת משמאל היא תוצאה של השפעות מוגבלות של קשירת פני השטח והשפעות אנדוציטיות. מכיוון שהתאים נחשפים לחומר המסירה למשך אותו פרק זמן כמו התאים המטופלים. מימין נמצאת אוכלוסיית התאים החיים העוברים דרך המכשיר המיקרופלואידי תוך חשיפה לאותו ריכוז של דקסטרין כמו תאי הביקורת.
התאים באזור המוצלל נחשבים כלא נמסרים, והתאים מימין לשורה מוגדרים כתאים שנמסרו. לאחר השליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך פחות משעה אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, אופטומטריה לאחר החיים על מנת לענות על שאלות נוספות כמו יעילות אספקה ופונקציונליות חומרים לאחר פיתוחו.
טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הרפואה הרגנרטיבית לחקור תכנות תאים בתאים ראשוניים בוגרים באמצעות העברת חלבון ישירה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להגדיר ולהפעיל את מערכת הסחיטה העצמית עבור היישום הרצוי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה להחדרה של מקרו-מולקולות לתאי מטרה ללא שימוש בווקטור, באמצעות דפורמציה מכנית מהירה. הפרוטוקול מפרט את השימוש במכשיר מיקרו-פלואידי כדי לסייע לתהליך זה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה של התא
- מיקרופלואידיקה
- טכניקות להחדרה תוך-תאית
רקע
- פירוק מכני מציע גישה חדשנית להחדרת חומרים לתאים.
- שיטה זו יכולה להתמקד בסוגי תאים מאתגרים שקשה להעביר להם טרנספקציה.
- יש לה יישומים פוטנציאליים בטיפול בסרטן ובמניפולציה של תאי מערכת החיסון.
- ציטומטריית זרימה משמשת להערכת יעילות ההחדרה.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה להחדרה תוך-תאית יעילה של מקרו-מולקולות.
- שיפור ההבנה של טכניקות לתכנות מחדש של תאים.
- הגברת היעילות הטיפולית של תאי מערכת החיסון נגד גידולים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ייצור ועיקור של התקן מיקרופלואידי.
- הכנת תרחיפי תאים וחומרי הובלה.
- הפעלת לחץ על ההתקן המיקרופלואידי כדי להשרות דפורמציה של התאים.
- ניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה להערכת הצלחת ההובלה.
תוצאות עיקריות
- הושגה העברה מוצלחת של מקרו-מולקולות לתאי מטרה.
- בדיקת Flow cytometry אישרה ספיגה תאי-פנימית יעילה.
- השיטה הראתה יתרונות על פני טכניקות העברה מסורתיות.
- הודגשו יישומים פוטנציאליים בטיפול בסרטן.
מסקנות
- שיטה מכנית זו להחדרה מהווה חלופה מבטיחה עבור סוגי תאים מאתגרים.
- היא פותחת נתיבים חדשים למחקר במניפולציה תאית ובטיפול.
- נדרשים מחקרים נוספים כדי למטב את הטכניקה עבור יישומים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הספקה תוך-תאית ללא וקטורים נותרת צוואר בקבוק קריטי בפיתוח טיפולי, במיוחד עבור תאי חיסון ראשוניים וסוגי תאים שקשה להחדיר אליהם חומרים (hard-to-transfect). פלטפורמת לחיצה מיקרופלואידית זו מאפשרת הספקה ציטזולית ישירה של מקרו-מולקולות וננו-חומרים ללא שינוי כימי או באפרים מיוחדים, ובכך מפחיתה עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות. על ידי שיפור יעילות ההספקה במערכות מאתגרות, השיטה תומכת בביטחון חיזוי בשלבי גילוי מוקדמים ומקטינה סיכונים במסלולים תרגומיים עבור יישומים של אימונותרפיה ורפואה רגנרטיבית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה תפקודית של היפותזות טיפוליות בתאי חיסון ראשוניים ובמודלים של תכנות מחדש.
- ערך תפעולי: מספק מערכת הדירה נטולת באפר להחדרת פקטורי שעתוק, נוגדנים או חומצות גרעיניות לצורך הערכת מעורבות המטרה.
- ערך ניבוי: תומך בהחלטות לגבי המשך או הפסקת הניסוי (go/no-go) על ידי אישור החדרה תוך-תאית של מולקולות אפקטוריות לפני ביצוע בדיקות תפקודיות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר תוצאות כמותיות מבוססות ציטומטריה של זרימה (flow-cytometry) של יעילות ההחדרה על פני סוגי תאים וריכוזי חומרים שונים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הכנת הדגימות באמצעות קצבי גזירה מבוקרים וגיאומטריית המכשיר, הממזערת שונות בסריקות בקיבולת גבוהה (high-throughput).
- מוכנות הבדיקה: מספקת נתוני אחוז החדרה ומדדי חיוניות המאפשרים דירוג של תרכובות או חומרים בתהליכי זיהוי מובילים (lead identification).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשר בין מודולציה של תאי חיסון בקנה מידה של גילוי להערכה פרה-קלינית של יעילות אנטי-גידולית מוגברת.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מאשר הובלה ציטוסולית של חלבונים אימונו-מודולטוריים, ובכך מפחית את ההסתמכות על מערכות ביטוי אנדוגניות.
- מערכות רלוונטיות למחלה: תומך בבדיקות בתאי T ראשוניים, תאים דנדריטיים ותאי גזע הרלוונטיים לאימונותרפיה של סרטן ולרפואה רגנרטיבית.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף שבין השלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומאפשרת בחינת השערות בביולוגיה מוקדמת, יצירת דגימות מוכנות לבדיקה לצורך סריקה, ותיקוף מנגנוני לפני מחקרים in vivo.
- ביולוגיה של גילוי: מקל על תיקוף מטרות על ידי העברת רכיבי CRISPR, siRNAs או נוגדנים כדי לאשש מעורבות של מסלולים בהפעלה חיסונית או בהכרעת גורל התא.
- סריקה: מעביר ספריות של נאנו-חומרים או פפטידים לתאי מערכת החיסון לצורך ספיגה וסריקה פונקציונלית תחת תנאי גזירה סטנדרטיים.
- אנליטיקה: מספק נתונים של יעילות הובלה ואחוזי חיוניות הנגזרים מציטומטריה של זרימה כנקודות קצה כמותיות להשוואת תנאים.
- מחקר תרגומי: מאפשר בדיקות פרה-קליניות של תאי חיסון מהונדסים עם מטענים מועברים להערכת פעילות של הריגת גידולים במודלים של תרביות משותפות.
- שימוש חוזר ארגוני: עיצוב הפלטפורמה מאפשר שימוש חוזר בסוגי תאים ובמטענים שונים באמצעות אופטימיזציה של לחץ ושבב בלבד, מה שתומך בפריסה ניתנת להרחבה בשלבי הגילוי ופיתוח תהליכים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית תוצאות שליליות שגויות בתיקוף של מטרות על ידי השגת הובלה לתאים ראשוניים ולתאים שאינם מתחלקים, שבהם שיטות מבוססות נגיפים או ליפידים נכשלות.
- ערך תפעולי: מבטל את הצורך בצימוד של המטען, בבופרים מיוחדים או בייצור נגיפי, ובכך מפשט את זרימת העבודה ומפחית את העלות לכל תנאי.
- ערך אסטרטגי: מגביר את הביטחון במועמדים למודולטורים חיסוניים בשלבים מוקדמים על ידי אישור הובלה תוך-תאית לפני ביצוע מחקרים בבעלי חיים הדורשים משאבים רבים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של ביולוגים התלויים בהובלה, כגון cytokine engagers או טיפולים בגורמי שעתוק, בהתבסס על ריכוזים ציטוסוליים שניתן להשיג.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול במכשירים מיקרופלואידיים, הכנת תרחיפי תאים וויסות לחץ כדי למנוע סתימות או מוות מסיבי עקב כוחות גזירה.
- תלוי בגישה לשבבים מיקרופלואידיים, ויסות לחץ, מערכות מאגרים וציטומטריה של זרימה לקריאת התוצאות; תואם לזרימות עבודה סטנדרטיות במCבטחת ביולוגית.
- מחייב סטנדרטיזציה של ריכוז התאים (1–10 מיליון/mL), סינון מוקדם דרך מסנני 40 µm וזמן הדגרה (≤10 min לאחר ההחדרה) לצורך הדירות בין משתמשים ואתרים שונים.
- דורש אופטימיזציה של הלחץ (למשל 70 PSI) ומהירות הזרימה עבור כל סוג תא ותכנון שבב כדי לאזן בין יעילות ההחדרה לבין החיוניות, כאשר אובדן החיוניות הוא בדרך כלל <20% בתנאים אופטימליים.
- מוגבל על ידי סתימות פוטנציאליות מצברים או פסדתיים, מה שמחייב סינון תאים והחלפה סדירה של השבבים; הביצועים משתנים בהתאם לגודל התא, קשיחות הממברנה והמשקל המולקולרי של המטען.
